植物抗旱基因HDCS1的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

張 莉，蘇曼琳

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 山西 太谷 030801；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083)

植物抗旱基因HDCS1的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

張 莉1，蘇曼琳2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 山西 太谷 030801；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083)

以二棱大麥幼苗Hordeum distichon Linn.中提取的總RNA為模板，通過RT-PCR的方法獲得與抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，并將此基因片段用PMD-19T載體進(jìn)行克隆，序列分析得知該目的片段HDCS1長約664 bp，含有一個(gè)完整的閱讀框，其編碼的蛋白質(zhì)屬于LEA蛋白，且HDCS1與Genebank中已報(bào)道的同源蛋白編碼基因HVA1（FJ026803.1）序列相似性為98.64%。以植物表達(dá)載體PBIl21為基礎(chǔ)，將HDCS1基因連接于組成型啟動(dòng)子CamV35S和NOS終止子之間，構(gòu)建植物表達(dá)載體PBI121-HDCS1并進(jìn)行PCR和酶切鑒定，為提高植物抗旱性研究奠定了基礎(chǔ)。

植物抗旱基因（HDCS1）；基因克隆；表達(dá)載體

干旱是影響植物正常生長發(fā)育的一個(gè)最重要的逆境因子，有關(guān)植物抗旱性能以及植物與干旱脅迫之間關(guān)系的研究一直受到人們的關(guān)注[1-2]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)與生物技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)能夠從分子水平上研究植物抗旱性能的機(jī)制。干旱脅迫會(huì)引起植物細(xì)胞脫水，從而誘導(dǎo)植物體內(nèi)多種抗性基因的表達(dá)。植物的抗旱性是一個(gè)復(fù)雜的多基因控制系統(tǒng)[3-5]，抗旱的轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控一系列抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，是一種十分有效的提高耐旱性的途徑。目前，已有研究從各種植物中發(fā)現(xiàn)和鑒定了幾十種與抗旱性相關(guān)的功能基因[6]。將這些基因轉(zhuǎn)入植物，對(duì)抗旱性都有了不同程度的提高。這些抗旱相關(guān)功能基因的發(fā)現(xiàn)，為人們通過抗旱基因工程改良植物的抗旱性開辟了新的途徑。

HDCS1基因最早是從二棱大麥中發(fā)現(xiàn)的抗旱基因，它與大麥中的一個(gè)抗旱基因HVA1具有高度的同源性[7]，但是關(guān)于它的系統(tǒng)研究還未見報(bào)道。本研究在此背景下，選擇對(duì)抗旱基因HDCS1進(jìn)行克隆，并構(gòu)建了HDCS1的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步利用抗旱基因HDCS1的優(yōu)異性能及價(jià)值并為下一步進(jìn)行該抗旱基因的轉(zhuǎn)化提供了前提條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

二棱大麥Hordeum distichon Linn.，種子先用自來水浸泡12 h，發(fā)芽后備用；

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株DH5α，質(zhì)粒PBIl21載體及載體PMD-l9T均購自大連TaKaRa生物工程有限公司。

1.1.3 酶及主要試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶；RNA抽提試劑盒、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、小量瓊脂糖凝膠回收試劑盒、酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒，均購自大連TaKaRa生物工程有限公司；DMSO等其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 二棱大麥的培養(yǎng)

二棱大麥的種子先用水浸泡12 h，然后用0.1 mmol/L的ABA澆灌幼苗，生長24 h后用DEPC水反復(fù)沖洗，然后用滅菌濾紙吸去表面水滴，稱取0.8 g莖葉組織備用；

1.2.2 RNA的提取和cDNA的克隆

采用Trizol試劑盒從二棱大麥的莖葉組織中提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。根據(jù)HVA1cDNA序列合成一對(duì)引物：

P1上游引物：5’-CGTGAGACGAAGATGG CCTCCAACC-3’

P2下游引物：5’-AAACACGACTAAAGGA ACGG-3’

通過隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，建立如下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：

200 μL EP 管中分別加入 2.5 μL cDNA 第一模板鏈、5 μL dNTPs、2.5 μL 反應(yīng)緩沖液、2 μL DMSO、各1 μL的上、下游引物（15 pmol），最后加入加ddH2O使反應(yīng)液總體積為25 μL；

進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)的程序設(shè)定如下：先95℃變形10 min，加入1 μL Taq DNA聚合酶，然后按94℃ 1 min、55℃ 53℃各 40 s、72℃延伸 90 s，共進(jìn)行35次循環(huán)。所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和紫外分析鑒定后，用小量瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收所需目的片段。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的克隆與測(cè)序分析

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收后，HDCS1基因片斷首先在T4連接酶的作用下與載體PMDTM-l9T連接，然后將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化已經(jīng)準(zhǔn)備好的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過藍(lán)白斑篩選后，用PCR的方法篩選以獲得陽性克隆，經(jīng)鑒定后命名陽性克隆重組子為PMD-HDCS1，由上海生工工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 植物表達(dá)載體PBI121-HDCS1的構(gòu)建

1.2.4.1 目的片段的修飾

將 2 μL 重 組 克 隆 質(zhì) 粒 PMD-HDCS1、2 μL Multi-core buffer、1 μL NcoI 和 15 μL ddH2O 組成的反應(yīng)體系于37℃溫浴1 h；經(jīng)電泳檢查消化完全后，加入 1 μL dNTPs、1 μL 大腸桿菌聚合酶ⅠKlenow片段，37℃溫浴20 min后再于75℃水浴10 min；降至室溫后加入1 μL SacⅠ,37℃溫浴1 h。采用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。

1.2.4.2 PBI 121 的酶切處理

取 2 μg PBI121、2 μL Multi-core buffer和 1 μL SamI 混勻后于25℃溫浴70 min，經(jīng)電泳檢測(cè)酶切完全后加入1 μL SacⅠ，37℃溫浴1 h。采用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。

1.2.4.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和檢測(cè)

將以上2種處理好的回收產(chǎn)物在T4連接酶作用下進(jìn)行連接并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后用40 mg/L 卡那霉素的LB平板培養(yǎng)篩選單菌落。挑選轉(zhuǎn)化后形成的單菌落，用小量提取試劑盒小量提取質(zhì)粒，用BarnH I和Sac I雙酶切方法鑒定陽性克隆，并將最終獲得的HDCS1基因的重組子命名為PBI121-HDCS1。

2 結(jié)果與分析

2.1 二棱大麥HDCS1基因的cDNA的RT-PCR擴(kuò)增

提取總RNA之后，經(jīng)分光光度計(jì)和凝膠電泳分析，提取的總RNA純度較高而且沒有發(fā)生嚴(yán)重降解。根據(jù)大麥相似基因HVA1cDNA序列合成的引物，PCR反應(yīng)后得到一段長約700 bp的DNA片段，如圖1所示。如圖1所示。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 RT-PCR product by agarose gel electrophoresis

2.2 目的基因片段的克隆與測(cè)序

RT-PCR產(chǎn)物切膠回收后，將目的片段連接到PMDTM-l9T載體上，以重組質(zhì)粒PMD-HDCS1為模板，以HDCS1的特異性序列為引物經(jīng)PCR擴(kuò)增可得一條長約700 bp的片段，表明PMDHDCS1中存完整的HDCS1片段。經(jīng)過測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其與Genebank中報(bào)道的大麥HVA1基因的cDNA序列同源性為98.64%。

重組質(zhì)粒PMD-HDCS1酶切鑒定結(jié)果如下：

圖2 HDCS1序列基因測(cè)序結(jié)果Fig. 2 HDCS1 gene sequence results by sequencing analysis

2.3 構(gòu)建植物表達(dá)載體PBI121- HDCS1

選擇常用的植物表達(dá)載體PBI121，首先用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ切除其GUS基因，然后用已獲得的HDCS1基因的cDNA片段進(jìn)行替換，最終構(gòu)建出一個(gè)以CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的HDCS1基因的植物表達(dá)載體 PBI121- HDCS1，酶切鑒定如圖3。

圖3 植物表達(dá)載體PBI121- HDCS1的酶切鑒定結(jié)果Fig. 3 Identification of PBI121- HDCS1 by restriction enzymes digestion注：其中1，2，3，M分別代表λDNA/HindⅢMarker，PBI121- HDCS1的酶切產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物和PCR Marker。

3 討 論

植物抗旱性屬多基因控制的數(shù)量性狀，通過常規(guī)育種方法改良作物抗旱性的效果往往不理想。借助基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，發(fā)掘、研究和利用植物抗旱相關(guān)基因是提高植物抗旱性的有效途徑。目前越來越多的研究的關(guān)注將相關(guān)抗旱基因及通過構(gòu)建表達(dá)載體載入來發(fā)揮其抗旱功能。

HDCS1是二棱大麥中編碼豐富蛋白（LEA蛋白）的一個(gè)基因，而LEA蛋白可以再大麥胚胎發(fā)生后期形成脫水保護(hù)，因此能夠在干旱脅迫時(shí)保護(hù)生物大分子，因而HDCS1基因的表達(dá)可以提高植物的抗旱性能[8-9]。大麥和二棱大麥?zhǔn)峭瑢俚慕壷参铮麄兊腖EA編碼基因幾乎相同。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，HDCS1與大麥的LEA蛋白編碼基因HVA1的序列同源性為98.64%，有研究表明這種差異是因?yàn)镠DCS1比HVA1少1個(gè)含有11個(gè)氨基酸殘基的基元序列。也有研究顯示，由11個(gè)氨基酸構(gòu)成的基元序列來編碼LEA蛋白是一種共性，該基元序列是中性的，成α-螺旋結(jié)構(gòu)，而這也可能是LEA蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的基因基礎(chǔ)[8]。本研究克隆了HDCS1基因并構(gòu)建了其植物表達(dá)載體PBI121- HDCS1，為進(jìn)一步進(jìn)行抗旱基因的轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，并為相應(yīng)植物的抗旱基因工程研究提供了參考。

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Cloning of plant drought-tolerant gene HDCS1 and construction of its expression vector

ZHANG Li1, SU Man-lin2
(1.College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2. Department of Forestry Science, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

∶ By using the total RNA extracted from the two-rowed barley seedlings Hordeum distichon Linn. as a template, the droughttolerant transcription factor gene was obtained with RT-PCR method. The gene fragments were cloned with the PMD-19T vector.Sequence analysis shows that the target fragment HDCS1 was about 664 bp, containing a complete open reading frame and the encoded protein belongs to the LEA proteins. The sequence similarity between HDCS1 and its homologous gene HVA1 (FJ026803.1,) reported in Genebank was 98.64%. Through plant expression vector PBIl21, HDCS1 genetic was connected between the constitutive promoter of CamV35S and NOS terminator to construct the plant expression carrier PBI121-HDCS1 and PCR, and the restriction endonuclease were used to digest. This study created a laid foundation to improve the drought resistance of plant.

∶ plant drought-tolerant gene (HDCS1); gene cloning; expression vector

S722.3+6

A

1673-923X(2012)06-0115-03

2012-03-22

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2011014)

張 莉(1979—)，女，山西襄汾人，博士，講師，主要研究方向：植物抗旱

[本文編校：吳 彬]