蛇皮果基因組DNA提取及其RAPD條件優化

李建光，李榮生，李發根，尹光天，楊錦昌，鄒文濤

（中國林業科學研究院 熱帶林業研究所，廣東 廣州 510520）

蛇皮果基因組DNA提取及其RAPD條件優化

李建光，李榮生，李發根，尹光天，楊錦昌，鄒文濤

（中國林業科學研究院 熱帶林業研究所，廣東 廣州 510520）

以蛇皮果頂梢嫩葉為材料，比較了CTAB法、改良CTAB法、CTAB-free法和SDS法對基因組DNA的提取效果，并對蛇皮果RAPD反應體系進行優化。結果表明，CTAB法、改良CTAB法和CTAB-free法均能提取出蛇皮果基因組DNA，其中NaCl濃度為5 mol/L的改良CTAB法因可更有效地去除多糖及酚類物質，并能滿足PCR擴增的要求而被認為是蛇皮果基因組DNA提取的最適方法；在15 μL的PCR擴增體系中，Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶的最優濃度分別為1.4 mmol/L、0.12 mmol/L和0.12 U/μL；PCR反應程序的最適退火溫度為39 ℃。

蛇皮果；DNA提取；RAPD優化

蛇皮果Salacca zalacca (Gaertner) Voss ex. Vilm.（=S. edulis Reinw）為棕櫚科Palmae蛇皮果屬果樹，具有果實外形奇異、果肉鐵鈣含量高、林下作業不曬和經營期長等優點，可在我國海南和云南熱帶地區栽培[1-2]。

有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而雌雄異株的蛇皮果通過有性繁殖生產的實生苗難以從形態上區分性別，而性別不分的實生苗造林后容易產生雌株分布不均、單產低和調整成本高等問題。因此蛇皮果實生苗性別鑒定是蛇皮果栽培亟需解決的問題之一。目前在銀杏和大麻上已可利用基因組DNA分子標記技術鑒定實生苗性別[3-4]，理論上基因組DNA分子標記技術也可用于蛇皮果實生苗性別鑒定。基因組DNA分子標記技術的首要工作是植株基因組DNA提取及其PCR擴增。然而目前如何提取蛇皮果基因組DNA及其PCR擴增卻還不清楚。有鑒于此，本研究以蛇皮果葉片為材料，篩選出蛇皮果基因組DNA的提取方法和RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)反應體系最佳條件，從而為開發RAPD分子標記鑒定蛇皮果性別和蛇皮果分子生物學研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 采樣

采樣果林位于海南省定安縣黃竹鎮南海農場試驗場，20世紀90年代中期種植，種源來自印度尼西亞。采集時間為2011年5月，共選擇20棵長勢健康的植株，采集植株中上部葉子的中上部新鮮的葉片，采下后用衛生紙除去表面灰塵及水分，每棵用塑料袋單獨封裝，一起用冰袋保鮮，帶回實驗室后在-70 ℃下保存。

1.2 基因組DNA提取方法

1.2.1 CTAB法

采用CTAB法進行蛇皮果葉片的總DNA提取，具體步驟如下：預先在10 mL離心管中加入4 mL 2% CTAB提取液（CTAB 20 g/L，NaCl 81.816 g/L，EDTA 9.306 g/L，Tris-HCl 12.114 g/L，pH 8.0），65 ℃保溫。稱取蛇皮果葉片1.2 g，剪碎，放入研缽，加液氮研磨至粉末狀。將研磨好的粉末狀葉樣加入預熱的提取液中，封口，65 ℃保溫60 min，每隔10 min搖動1次。將樣品在離心機上用11 000 r·min-1離心10 min，然后取上清液。往上清液中加入氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液4 mL，搖勻，再11 000 r·min-1離心10 min，取上清液；重復1次本步驟。向上清液中加入4 ℃冷藏的2 mL異丙醇，輕輕晃動混勻，在-20 ℃下靜置1 h以上。取冷凍液，11 000 r·min-1離心10 min，倒掉上清液，加入2 mL無水乙醇洗兩次，洗后將管倒置于衛生紙上吸干，在真空濃縮儀中干燥5 min左右。加入1 mL 1×TE，溶解沉淀的DNA，彈動或震蕩以充分溶解，放入冰箱備用。DNA濃度通過與100 bp DNA Ladder（購自Sangon公司）的500 bp片段亮度對比進行[5]。

1.2.2 改良CTAB法

改良的CTAB法是在2% CTAB提取液中加入了2% β-巰基乙醇和5% PVP-40，而且在加入4℃冷藏的2 mL異丙醇之前加入2 mL濃度為5 mol/L的NaCl，其它步驟與CTAB法相同。

1.2.3 CTAB-free法

CTAB-free法首先將研磨好的蛇皮果葉樣加入到4 mL CTAB-free提取液（PVP 15 g/L，NaCl 81.816 g/L，EDTA 9.306 g/L，Tris-HCl 12.114 g/L，pH 8.0）和2% β-巰基乙醇中，在冰上冰浴10 min，然后7 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液[6]。在沉淀中加入3% CTAB提取液，其它步驟與改良CTAB法相同。

1.2.4 SDS法

SDS法主要是將CTAB法中的提取液換成2% SDS提取液，其它步驟與CTAB法相同[7]。

1.3 PCR擴增方案的優化

1.3.1 擴增體系的優化因子

擴增體系的優化因子包括Mg2+濃度、dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶濃度（見表1）。PCR擴增體系的優化以改良CTAB法提取的蛇皮果基因組DNA為材料，利用隨機引物S2007、S2008、S2009、S2010、S2011、S2074、S2075、S2076、S2077、S2078、S2081、S2082、S2083、S2084、S2085進行(引物序列見表2，均購自Sangon公司)。15 μL擴增反應體系基本組成為：1.5 μL 10×緩沖液[Tris-HCl 100 mmol/L(pH 9.0)、KCl 100 mmol/L、NP-400.5 %、(NH4)2SO480 mmol/L]、0.2 mmol/L dNTPs、0.1 U/μL Taq DNA 聚 合 酶、1.8 mmol/L Mg2+、1.0 μmol/L RAPD 引物、12 ng DNA模板，補加ddH2O至15 μL。

表1 蛇皮果PCR擴增體系的優化設計Table 1 The optimization design of salak PCR amplification system

表2 蛇皮果基因組DNA擴增優化所用RAPD 隨機引物名稱及其堿基序列Table 2 The RAPD random primers and base sequences of this study

1.3.2 擴增程序的優化

PCR擴增程序的優化是在優化的擴增體系的基礎上，以改良CTAB法提取的蛇皮果基因組 DNA為材料，利用 S2093、S2094、S2095、S2096和S2097共5個隨機引物進行(引物序列見表2)。基本擴增程序為：94 ℃預變性2 min；再40個循環：94 ℃變性30 s，36 ℃退火30 s和72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸10 min。擴增程序的優化主要是針對退火溫度的調節，退火溫度設置為34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃。PCR擴增儀為GeneAmp PCR System 2700(Applied Biosystem Co.) 。擴增產物用含有0.05 μL/mL Gold ViewTM（購自北京賽百盛基因技術有限公司）的1.2 %瓊脂糖凝膠在0.5×TBE緩沖液中電泳分離檢測，電泳結果通過WD-9403F紫外儀成像。

1.3.3 優化結果的檢驗

在完成1.3.1和1.3.2內容后總結出優化的擴增體系參數，利用蛇皮果1個DNA樣品，采用該擴增體系和編號為S23-32的隨機引物(引物序列見表2) 進行擴增，觀察擴增后的電泳譜帶，檢驗優化體系的適用性。

2 結果與分析

2.1 DNA提取方法

4種方法提取的DNA的電泳如圖1所示。由圖可以看出，改良CTAB法、CTAB-free法和CTAB法均能提取出蛇皮果的基因組DNA，而SDS法提取的效果較差。然而3種可提出基因組DNA的方法中，CTAB-free法跑出的條帶比較分散，CTAB法跑出的條帶有拖尾現象，而改良CTAB法提取的蛇皮果基因組DNA在質量和數量上均能滿足大量PCR擴增的需要，可以作為優先選用的方法。

圖1 蛇皮果不同方法提取的基因組DNA的電泳結果Fig. 1 Pattern of genome DNA by different methods

2.2 PCR擴增體系的優化

2.2.1 Mg2+的最佳濃度

不同Mg2+濃度擴增后的電泳結果見圖2，圖中11～15譜帶比M除外的其它譜帶清晰，其對應的Mg2+濃度為1.4 mmol/L，即此濃度為蛇皮果基因組DNA擴增體系中Mg2+的最佳濃度。

2.2.2 dNTPs最佳濃度

圖3顯示dNTPs 濃度在0.12 mmol/L產生的條帶比較清晰，因而此濃度為蛇皮果基因組DNA擴增體系中dNTPs的最佳濃度。

2.2.2 Taq DNA聚合酶濃度

Taq DNA聚合酶濃度在0.09 U/μL時條帶已經很清晰（見圖4），但引物S2078在0.12 U/μL時才擴增出了條帶，為了最大限度的擴增出條帶將Taq DNA聚合酶濃度定在0.12 U/μL。

2.2.3 退火溫度

對于PCR擴增程序中退火溫度的調節（見圖5），從圖中可看到在較大片斷（1 500 bp） 的擴增中，6個溫度梯度的清晰度差異并不太大。而擴增出的較小片段中，38 ℃和40 ℃得到的條帶更清晰些，取其中間值為39 ℃。

2.2.4 優化結果的檢驗

圖2 不同Mg2+濃度的蛇皮果基因組DNA擴增體系擴增的DNA的電泳譜帶Fig. 2 The RAPD PCR results with different concentrations of Mg2+

圖3 不同dNTPs濃度的蛇皮果基因組DNA擴增體系擴增的DNA的電泳譜帶Fig.3 The RAPD PCR results with different concentrations of dNTPs

圖4 不同Taq DNA聚合酶濃度的蛇皮果基因組DNA擴增體系擴增的DNA的電泳譜帶Fig. 4 The RAPD PCR results with different concentrations of Taq DNA polymerase

圖5 不同退火溫度下蛇皮果基因組DNA擴增的DNA的電泳譜帶Fig. 5 The RAPD PCR results with different annealing temperature

利用上述優化的擴增體系和擴增程序對蛇皮果1個樣品10個隨機引物的擴增表明(見圖6)，多數條帶清晰，擴增背景比較干凈，擴增片斷的大小范圍也較大。所以，最終確定蛇皮果RAPD技術的PCR擴增體系為15 μL體系：10×buffer 1.5 μL，0.12 mmol/L dNTPs，0.12 U/μL Taq DNA聚合酶，1.4 mmol/L Mg2+，1.0 μmol/L RAPD引物，12 ng DNA模板。PCR擴增程序為：94 ℃預變性2 min；再40個循環：94 ℃變性30 s，39 ℃退火30 s和72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸10 min。

3 結論與討論

圖6 優化方案對10個隨機引物PCR的DNA的電泳譜帶Fig. 6 The RAPD PCR results of salak genomic DNA

目前，對基因組DNA提取方法研究報道很多，但較難解決的是多糖類物質的去除。由于多糖的許多理化性質與核酸相似，因此用氯仿抽提、選擇性沉淀等常規方法不能有效地去除多糖。由于多糖可以抑制許多酶活性[8]，有多糖污染的DNA樣品純度較低，無法順利進行PCR擴增，因此必須盡量避免提取過程中的多糖污染。蛇皮果富含多糖和酚類物質，過多的多糖將影響后期PCR擴增效果，所以多糖的去除是本實驗的關鍵步驟。本實驗首先采用CTAB法和SDS法進行基因組DNA的提取，由于未采取去除多糖的措施，故所得DNA沉淀為一團膠狀物，而且加入1×TE進行溶解DNA時需要很長的時間，通過電泳檢測可以看出（見圖1）受多糖和雜質的影響兩種方法跑出的效果都不好，CTAB法的拖尾現象比較嚴重，而SDS法只有一條很模糊的條帶。采用CTAB-free法提取的基因組DNA雖然無拖尾現象而且條帶比較清晰，但由于在第一步除多糖的過程中同時也洗去部分的基因組DNA，從而造成基因組DNA量的減少，同時有少量DNA降解，造成跑出的電泳條帶比較分散。改良的CTAB法首先在緩沖液中加入了β-巰基乙醇和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP），β-巰基乙醇能抑制酚類物質的氧化，PVP作為酚類物質結合劑，可吸附多酚分子上的氫鍵，形成水不溶性復合物[9]，從而有效的去除蛇皮果當中的酚類物質。同時，PVP作為澄清劑，具有吸附作用[10]，能吸附多糖將其除去。提高NaCl濃度是去除多糖的一種有效方法，周詩捷等[11]對華南五針松成熟針葉提取基因組DNA時，將NaCl濃度提高到2 mol/L并取得較好的提取效果。但在本實驗中只有將NaCl濃度提高到 5 mol/L 時才能有效去除多糖。通過上述分析以及電泳檢測結果最終選用改良CTAB法作為蛇皮果的基因組DNA提取方法。

通過對蛇皮果RAPD反應體系優化的研究，有利于建立有效的擴增體系和擴增程序，為蛇皮果分子生物學研究提供技術支持。在擴增體系中，Mg2+濃度會影響到酶的活性、合成的忠實性、引物與模板的結合效率和退火溫度等方面[12]。從試驗設置的4個濃度梯度來看，隨著Mg2+濃度的增加，PCR擴增所產生的條帶越來越清晰，而且產生的帶型也逐漸的增多。但是，當濃度增加到一定程度時會導致非特異性擴增和引物二聚體的形成。根據電泳檢測的結果最終確定了Mg2+濃度為1.4 mmol/L。擴增體系中dNTPs濃度過高會導致Taq DNA聚合酶錯誤摻入，而且還會與反應混合液中的Taq DNA聚合酶競爭Mg2+，抑制酶的活性。所以dNTPs 濃度和Taq DNA聚合酶濃度需要達到一定的平衡狀態。一般RAPD技術中PCR擴增的退火溫度都在35℃～40℃之間[13]，溫度過高會抑制PCR擴增。但是Parasnis[14]研究番木瓜時使用的退火溫度達到45℃，而且李發根等[15]對棕櫚藤研究的退火溫度也達到45℃，說明采用RAPD技術進行分子標記研究時，退火溫度范圍較大。本實驗的退火溫度從34℃到44℃設置了6個梯度，從電泳圖中可以看出不同的退火溫度之間的差異并不太大，這佐證了RAPD技術中PCR擴增程序退火溫度適宜范圍較廣，也證明了RAPD反應在退火溫度上具有較高的穩定性和可重復性。

致謝：中國林業科學研究院熱帶林業研究所研究員甘四明博士和碩士生于曉麗對本研究給予建議和實驗協助，特此感謝！

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DNA extraction and RAPD Condition optimization for Salacca edulis Reinw

LI Jian-guang, LI Rong-sheng, LI Fa-gen, YIN Guang-tian , YANG Jin-chang, ZOU Wen-tao
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

∶ By taking the tender leaves on top-shoots of Salacca edulis as tested materials, the extraction effects of CTAB, improved CTAB, CTAB-free and SDS on the genomic DNA of salak were investigated and compared. And the reaction system of salak RAPD was optimized. The results show that CTAB, improved CTAB, CTAB-free all could extracted out genomic DNA from salak, of them,the improved CTAB with NaCl concentration of 5 mol/L could more effectively remove polysaccharides and polyphenols than the other two methods, and meet the requirement of PCR amplification, so it is the best method. The optimal concentrations of Mg2+, dNTPs, Taq DNA polymerase and the annealing temperature are 1.4 mmol/L、0.12 mmol/L, 0.12 U/μL and 39 ℃ respectively for the PCR progress for salak.

∶ Salacca edulis; salak; DNA extraction; RAPD optimization

S789.5

A

1673-923X(2012)06-0110-05

2012-01-17

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項項目“蛇皮果栽后遮蔭和灌溉技術研究”(編號：RITFKYYW2010-02)；國家林業局948引進項目“蛇皮果栽培品種及配套栽培技術引進”（編號：2007-4-11）

李建光(1984—)，男，河北廊坊人，碩士研究生，主要從事種苗培育理論與技術研究

李榮生(1975—)，男，福建仙游人，博士，副研究員，主要研究蛇皮果和棕櫚藤的種質資源收集及其評估、育種和培育理論及技術；E-mail:fjlrs@tom.com

[本文編校：羅 列]