金蓮花中葒草苷在兔體內(nèi)組織中的分布特征研究

陳鳳平，曲彩紅，安 芳，王書華

（1.河北科技大學(xué)黨政辦公室，河北石家莊 050018；2.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北張家口 075000）

金蓮花中葒草苷在兔體內(nèi)組織中的分布特征研究

陳鳳平1，曲彩紅2，安 芳2，王書華2

（1.河北科技大學(xué)黨政辦公室，河北石家莊 050018；2.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北張家口 075000）

建立HPLC法測定兔組織中葒草苷含量的方法，研究靜脈給藥時，葒草苷在新西蘭白兔體內(nèi)組織中的分布特點(diǎn)，葒草苷給藥后，分時采集組織樣品，放血處死動物，取出心、肝、腦、腎、肺、脾組織并制備勻漿，以HPLC法測定兔組織中葒草苷含量，采用統(tǒng)計(jì)矩理論計(jì)算各個組織的AUC。組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾葒草苷的測定，在0.050 0～50.0 mg／L范圍內(nèi)，葒草苷質(zhì)量濃度和峰面積線性關(guān)系良好，定量下限為0.050 0 mg／L。精密度、準(zhǔn)確度和加樣回收率RSD值均小于15%。各組織的AUC順序?yàn)槟I＞肝＞肺＞脾＞心＞腦。將各組織AUC進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，依次進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果顯示，不同組織的AUC有顯著性差異（p＜0.05），葒草苷在新西蘭白兔體內(nèi)主要組織中的含量分布有明顯不同。

葒草苷；分布；HPLC

金蓮花是毛茛科屬植物金蓮花的干燥花及花蕾，在中國主要產(chǎn)于山西、河北、內(nèi)蒙、遼寧等省區(qū)。金蓮花作為中醫(yī)藥歷史悠久，主要含有黃酮類、有機(jī)酸、揮發(fā)油等［1－3］化學(xué)成分。前期研究表明，金蓮花總黃酮具有體外抗氧化、抗癌等［4－8］藥理活性。葒草苷在金蓮花總黃酮中含量較高［9］。葒草苷具有抗血栓、對缺血缺氧心肌有保護(hù)作用［10－11］。目前，對葒草苷的研究主要集中在其藥理作用上，對其兔體內(nèi)組織分布的研究尚未見報(bào)道［12］。該實(shí)驗(yàn)的完成，為進(jìn)一步闡明葒草苷在人體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)過程及藥物的臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。同時，對葒草苷作為一種臨床新藥開發(fā)有非常重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

新西蘭純種白兔，體重（2.3±0.3）kg，♂ ，由河北北方學(xué)院動物中心提供，室溫飼養(yǎng)1周。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀，Heraeus高速冷凍離心機(jī)，GR-202型分析天平，DY89-I型電動玻璃勻漿機(jī)。野生金蓮花采自河北省張家口市沽源縣，經(jīng)河北北方學(xué)院藥物研究所鑒定為金蓮花，葒草苷、牡荊苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供），動物實(shí)驗(yàn)用葒草苷由河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供（純度達(dá)98%以上），乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為化學(xué)純，實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。

2 方法、結(jié)果與討論

2.1 兔給藥后組織中葒草苷的含量測定

2.1.1 給藥方案和組織樣品采集

新西蘭白兔42只，禁食過夜12 h，自由飲水，隨機(jī)分組，每組6只，隨機(jī)分成7組，耳緣靜脈注射葒草苷（20 mg／kg）后，于5，10，15，30，45，60，75 min分別放血處死，迅速解剖，采集心、肝、腦、腎、肺和脾各3.5 g。

2.1.2 組織勻漿液的制備與處理方法

各組織用生理鹽水沖凈表面浮血，用濾紙吸干表面水分后，精密稱重，剪碎，按1 g∶1 m L比例加入相應(yīng)體積的生理鹽水，用電動勻漿器在冰浴下勻漿，制備50%（體積分?jǐn)?shù)）的組織勻漿液。將勻漿液4 000 r／min離心10 min后，取上清液200μL，加入2倍體積的乙腈沉淀蛋白，10 000 r／min離心10 min去除蛋白后，收集上清液，0.45μm的微孔濾膜過濾后，置－20℃冷凍保存?zhèn)錅y。

2.1.3 HPLC測定條件

色譜柱為 Hypersil BDS-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相為V（1%乙酸）∶V（乙腈）＝85∶15；檢測波長為340 nm；柱溫30℃；流速1 m L／min；進(jìn)樣量20μL。

2.1.4 各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取上述各組織的上清液1 m L，加入不同量的葒草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制質(zhì)量濃度分別為0.050 0，0.100，0.500，2.50，5.00，10.0，12.5，25.0，50.0 mg／L的一系列葒草苷各組織勻漿液樣品，按組織勻漿處理方法處理，HPLC測定，用葒草苷的峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得到兔各組織勻漿液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明在0.050 0～50.0 mg／L范圍內(nèi)，葒草苷質(zhì)量濃度和峰面積線形關(guān)系良好，r＝0.998 6～0.999 5，定量下限為0.050 0 mg／L。在色譜條件下檢測組織樣品中葒草苷，葒草苷的保留時間為4.9 min，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾葒草苷的測定。

2.1.5 方法的精密度和準(zhǔn)確度

取空白各組織液100μL，配制高、中、低3個質(zhì)量濃度的組織樣品，質(zhì)量濃度分別為0.100，10.0，40.0 mg／L，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法同法測定，每個質(zhì)量濃度平行測定5次。將這3個質(zhì)量濃度樣品日內(nèi)不同時間測定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度。在同一周內(nèi)的不同日將上述3個樣品分別測定5次計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示：精密度和準(zhǔn)確度均符合生物分析方法指導(dǎo)原則的要求，RSD值小于15%。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取空白組織液100μL，配制2個質(zhì)量濃度的組織樣品，質(zhì)量濃度分別為2.50，50.0 mg／L，3個樣本。分別在室溫放置6 h和24 h后重新進(jìn)樣，并以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定質(zhì)量濃度，取這2個質(zhì)量濃度的3個樣本經(jīng)3次冷凍融解后進(jìn)行濃度測定，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，葒草苷組織樣品在室溫放置6 h和24 h后，樣品準(zhǔn)確度的RSD均小于15%，說明樣品在室溫條件下6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，每天可以進(jìn)行大批量的樣品處理。凍融實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD值小于15%，說明其在此條件下，穩(wěn)定性良好。

2.1.7 組織分布

新西蘭白兔經(jīng)耳緣靜脈注射葒草苷后，各組織藥物質(zhì)量濃度和時間數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果表明，不同組織同一時間葒草苷含量呈顯著性差異（p＜0.05），兔體內(nèi)葒草苷以整體平均含量從5～75 min其下降幅度為88.5%，其器官在5～75 min葒草苷從其濃度的高峰至低峰，下降幅度分別為心臟93.7% 、肝臟93.8% 、腦79.4%、腎臟95.9% 、肺76.2% 、脾臟95.1% 。心臟、肝臟、腦、腎、肺、脾組織中藥時曲線下面積AUC值分別為23，226，12，452，149，41μg·min／g。

表1 葒草苷在各組織中的含量Tab.1 Concentration of orientin in different tissues

2.2 討 論

2.2.1 葒草苷生物樣品的處理方法

葒草苷屬于黃酮類化合物目前，黃酮類化合物生物樣品的處理方法有以下幾種：蛋白沉淀法和液液萃取法、固相萃取法。該實(shí)驗(yàn)中所用的組織中含有大量蛋白，它們能與藥物結(jié)合，影響藥物的檢測，本實(shí)驗(yàn)采用了沉淀蛋白的方法。實(shí)驗(yàn)中篩選甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯幾種有機(jī)溶劑用來沉淀蛋白，通過比較，乙腈沉淀的蛋白較細(xì)，經(jīng)HPLC檢測，乙腈中葒草苷的含量高于其他溶劑，而且沒有出現(xiàn)溶劑效應(yīng)影響色譜峰的現(xiàn)象，用乙腈保證了色譜峰型的對稱，又保證了高的除蛋白率，所以最終確定了用2倍體積的乙腈來沉淀蛋白。

2.2.2 色譜條件的確定

在此色譜條件下，通過對葒草苷組織樣品方法學(xué)考察，對照品和處理過的空白樣品、回收率的測定及穩(wěn)定性的考察，得出此分析方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性較好等特點(diǎn)，適宜葒草苷在血漿及兔體內(nèi)的分析。

2.2.3 葒草苷的組織分布

藥物在體內(nèi)的分布與藥理作用有密切關(guān)系，決定了藥效的強(qiáng)弱和作用的持續(xù)時間。本實(shí)驗(yàn)考查了葒草苷靜脈注射后在兔體內(nèi)的組織分布情況。研究發(fā)現(xiàn)，隨著時間的變化，兔靜注葒草苷后，以腎、肝、肺中葒草苷含量最高，這可能與臟器中血管豐富、血流量大有關(guān)。葒草苷在腦組織中的含量最低，可見葒草苷不易透過血腦屏障。給藥后，隨時間變化，除腎組織外，其他各組織中葒草苷含量均呈逐漸下降趨勢。給藥后15 min時，葒草苷在腎組織中含量達(dá)最高。這證實(shí)了中醫(yī)理論所認(rèn)為的金蓮花具有清熱解毒、滋補(bǔ)腎陰、利尿通便的作用。兔體內(nèi)葒草苷以各組織整體平均含量從5～75 min其下降幅度為88.5%，說明葒草苷不會在兔體內(nèi)產(chǎn)生蓄積中毒的現(xiàn)象。

采用統(tǒng)計(jì)矩理論計(jì)算各組織的AUC，各組織中AUC順序?yàn)槟I＞肝＞肺＞脾＞心＞腦，說明葒草苷在腎中分布最多，在腦中分布最低。將各組織AUC進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，依次進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果顯示，不同組織的AUC有顯著性差異（p＜0.05）。

本實(shí)驗(yàn)研究了葒草苷在兔體內(nèi)的組織分布情況，但其在動物體內(nèi)代謝情況如何？發(fā)揮藥效是原型藥物還是其代謝物？代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如何？了解這些對研究其作用機(jī)制、明確金蓮花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)將有重要的參考價值。這些還有待進(jìn)一步研究。

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Distribution of orientin fromTrollius Chinensisin tissue of rabbits

CHEN Feng－ping1，QU Cai-hong2，AN Fang2，WANG Shu-hua2

（1.Department of Party and Government Administration，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018，China；2.Department of Pharmacology，Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China）

A method using HPLC is established to determine orientin in tissue of rabbits and to study the characteristic of the orientin when injected into veins.After orientin is injected into veins，tissue samples are collected at time sharing.The rabbit is put to death by bloodletting，then the heart，liver，brain，kidney，lung and spleen are taken out to prepare homogenate tissue.HPLC is used for determination of orientin in tissue of rabbits.Theory of statistical moment is used to account AUC of each tissue sample.Endogenous material in tissue does not interfere in determination of orientin.In amplitude of 0.050 0～50.0 mg／L，mass concentration of orientin and peak area have a good linear relation，and the quantitation of lower limit is 0.050 0 mg／L.The RSD of precision，accuracy and plus sample recovery are all less than 15%.The AUC order of each tissue is kidney＞liver＞lung＞spleen＞heart＞brian.After log transition of AUC data，normality test，homogeneity test for variance and analysis of variance are conducted.The result shows AUC of each tissue have significant difference（p＜0.05）.Orientin distribute in dominating tissue of rabbits is obviously different.

orientin；distribution；HPLC

R285.5

A

1008-1542（2012）01-0036-04

2011-10-16；

2011-11-26；責(zé)任編輯：李 穆

河北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2008101）

陳鳳平（1965-），女，河北灤南人，副教授，主要從事機(jī)關(guān)及教學(xué)管理方面的工作。

王書華教授