番茄高效再生體系的建立

仇 燕，劉紅霄，楊松燁

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018）

番茄高效再生體系的建立

仇 燕，劉紅霄，楊松燁

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018）

以砧木1號番茄的子葉和下胚軸為外植體進行離體組織培養，研究了IAA和6-BA及NAA和6-BA不同激素配比對外植體誘導不定芽及生根的影響。結果表明：培養基MS＋0.2 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA為誘導子葉外植體愈傷組織和不定芽的最適培養基，而 MS＋0.5 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA為誘導下胚軸外植體愈傷組織和不定芽的最適培養基；誘導不定芽生根的最佳培養基為 MS＋0.1 mg／L IAA。

番茄；子葉；下胚軸；植株再生

番茄作為一種重要的蔬菜作物和模式經濟作物已受到眾多研究者的關注，番茄轉基因的研究是當前植物基因工程研究的熱點之一，番茄的廣泛栽培和它在遺傳理論上的深入研究，為基因工程拓寬資源打下了堅實基礎［1］。作為影響基因轉化成功與否的關鍵因素之一，建立高頻再生體系的研究一直很受重視［2］。

本試驗選用砧木1號番茄種子，比較了不同殺菌劑和殺菌時間對番茄種子萌發的影響，確定了最佳殺菌劑及殺菌時間，并且以番茄無菌苗的下胚軸和子葉作為外植體，通過對不同激素濃度配比進行試驗，篩選出能夠高效誘導番茄外植體直接分化不定芽和誘導不定芽生根的培養基，建立了一套高效的番茄植株再生體系，以期為進一步的番茄轉基因和功能基因組學的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養基

砧木1號番茄種子由本實驗室保存。培育無菌苗使用含有去離子水的棉花基質；誘導培養基以MS為基本培養基，含有蔗糖質量濃度30 g／L、瓊脂質量濃度8 g／L，添加不同種類和濃度的激素，調節p H值至5.8。配制好的培養基于120℃高溫滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子的處理

選取籽粒飽滿的健康種子置于錐形瓶中，無菌水沖洗1次，70%（體積分數，下同）酒精處理20 s后分別用0.05%～0.1%（質量分數）的氧化汞和10%（質量分數）的NaClO消毒，后用無菌水沖洗種子7遍。

1.2.2 無菌苗的培養

滅菌后的種子接種于棉花培養基上，25℃條件下（以下試驗都是在該溫度條件下進行）黑暗培養，5 d后計算發芽率，然后轉至光照周期14 h／d，光照度為2 000 lx的條件下培養，待幼苗子葉完全展開時備用。

1.2.3 外植體的準備

取培養約10 d的無菌苗，將子葉兩端及葉邊緣切除，中間部分橫向切成2段，再在葉塊中間劃2處傷口；下胚軸剪成8 mm左右的切段。將切好的外植體接種在不同質量濃度的附加IAA（0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）和6-BA（0.5 mg／L，1.0 mg／L，2.0 mg／L）及 NAA（0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）和6-BA（0.5 mg／L，1.0 mg／L，2.0 mg／L）的 MS培養基上，每種培養基接種子葉和下胚軸各10塊，每個處理設3個重復。黑暗培養7 d后，轉移至14 h／d光照周期條件下培養，28 d后統計外植體的出愈率和不定芽的分化率。外植體的出愈率＝（誘導愈傷組織外植體數／接種外植體數）×100%，不定芽的分化率＝（分化不定芽的外植體數／接種外植體數）×100%。

1.2.4 生根培養

待不定芽長至2 cm左右時，切除不定芽基部的愈傷組織和培養基，將不定芽轉接到含有不同質量濃度的IAA（0.05 mg／L，0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）或 NAA（0.05 mg／L，0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L）的生根培養基中，進行生根培養。每種培養基中接種不定芽8塊，每個處理設3個重復，10 d后統計不同質量濃度IAA或NAA培養基中不定芽的生根率。生根率＝（生根幼芽數／接種幼芽數）×100%，同時觀察根的形態。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌劑和滅菌時間對番茄種子滅菌及萌發的影響

NaClO處理過的種子表皮褪色變白，由表1可見，不同滅菌時間對種子的萌發影響不大，但是4～6 min處理后有少量霉菌污染；氯化汞處理過的種子較NaClO處理后的種子萌發晚且萌發率低，并且隨著氯化汞殺菌濃度的增大，時間的增長，種子的萌發率明顯降低，說明氯化汞處理對種子的萌發有一定的抑制作用。試驗表明，最佳滅菌條件為70%酒精處理20 s后NaClO處理7 min。

表1 不同滅菌條件對種子萌發的影響Tab.1 Effects for seeds germination with different sterilization condition

2.2 不同激素配比對番茄愈傷組織和不定芽誘導的影響

外植體接種5 d后，傷口處膨大，開始形成愈傷組織（見圖1和圖2）；13 d后，子葉外植體開始出現芽點并逐漸長成不定芽；18 d后，下胚軸開始出現芽點，不定芽開始生長（見圖3）。本試驗選用NAA與6-BA的激素組合可以誘導外植體愈傷，但是誘導不定芽分化的效率卻極低，只能達到20%左右，且分化形成畸形芽較多，不能生長成完整植株。

由表2可見，在IAA與6-BA激素組合中，子葉與下胚軸出愈率相差不大。在不同激素濃度的培養基中，子葉外植體和下胚軸外植體的出愈率都在90%以上，下胚軸總體出愈率雖略低于子葉，但差異不明顯，在6-BA質量濃度為1.0 mg／L時，下胚軸和子葉的出愈率都達到100%，說明該質量濃度的6-BA最有利于愈傷的誘導。不同外植體誘導愈傷和不定芽分化的最佳激素配比并不相同：誘導子葉生芽的最佳激素組合是IAA（0.2 mg／L）＋6-BA（1.0 mg／L），出芽率高達97%；誘導下胚軸生芽的最佳激素組合是IAA（0.5 mg／L）＋6-BA（1.0 mg／L），出芽率達到77%。相同激素組合中，子葉與下胚軸分化不定芽的能力相差甚遠，子葉作為外植體均比下胚軸誘導再生芽的效率高，特別是在本試驗的最優條件下（子葉在5號培養基，下胚軸在6號培養基）子葉的出芽率比下胚軸高20%。

表2 不同激素配比對番茄愈傷組織和不定芽誘導的影響Tab.2 Effects of different combination of hormone concentration on tomato callus and buds induction

2.3 不同激素及濃度對番茄外植體生根的影響

待培養的幼芽長到2 cm左右且具有2－3個葉片時，切除不定芽下的愈傷組織，將不定芽轉接到不同濃度的IAA或NAA生根培養基中誘導生根（圖4）。試驗發現，加入IAA的培養基比加入NAA的培養基更有利于番茄不定芽的生根誘導，不僅生根時間短，再生根也比較粗壯。由表3可見，當IAA質量濃度為0.05 mg／L時，誘導的主根較細；質量濃度為0.1 mg／L時，誘導的主根較粗且根系發達、須根多，再生苗也較高；質量濃度為0.2 mg／L時，根系依舊很發達，但再生苗高度比0.1 mg／L時低；質量濃度為0.5 mg／L時，根系較弱，基本無須根，并且生根率明顯低于其他濃度。這種變化說明適當提高IAA濃度有利于不定芽的生根，但是超過一定質量濃度后，反而會抑制根的發生。故筆者認為0.1 mg／L為誘導不定芽生根的最佳IAA質量濃度。

待番茄幼苗生長到6～8 cm，根長為5～6 cm時，打開錐形瓶封口膜，在錐形瓶中注入約0.5 cm水后轉移到培養箱中進行馴化培養，培養箱溫度為白天24℃夜間18℃，光照周期為14 h／d（見圖5）。2～3 d后，從錐形瓶中取出小苗洗去根部培養基防止細菌滋生，將再生植株轉移到注入1 cm水的錐形瓶中，室溫（20～25℃）下生長。4 d后，移栽到營養土中（見圖6），移栽成活率達到100%。

表3 不同濃度IAA對不定芽生根的影響Tab.3 Effect of IAA concentration on adventitious buds generating roots

3 討 論

3.1 不同滅菌劑對番茄種子發芽的影響

獲得無菌苗是植株再生的第1個步驟，以往番茄種子的滅菌主要以氯化汞滅菌法為主，但也有報道指出氯化汞對種子的萌發可能有一定的抑制作用。本試驗結果表明，NaCl O處理的種子比氯化汞處理的種子發芽時間更短，發芽率更高。氯化汞抑制種子萌發的原因可能在于氯化汞在種子表面的殘留不易去除，從而導致種子不能萌發，而次氯酸鈉最后分解成氯和氧氣排入大氣中，滅菌后易于去除［3］，不會再損傷種子。

3.2 不同外植體再生能力的比較

番茄的不同部位外植體再生能力不盡相同，梁美霞發現番茄下胚軸的愈傷組織誘導和不定芽誘導均低于子葉誘導，這與本試驗得出的結論是一致的［4］。而子葉作為外植體比下胚軸更容易形成不定芽的原因可能在于子葉是營養儲存器官，可以為芽的生長提供更為充足的營養［5］。歐陽波等的研究則相反［6］，這可能與不同番茄品種的內源激素的含量和種類有關。陳火英等的實驗證明離體培養誘導發生過程中，物理創傷作用對啟動愈傷組織有明顯的作用［7］，故在制備外植體時應盡量多的制造外植體傷口，本試驗不僅切除了子葉的邊緣同時在子葉切塊的中部也劃出傷口，以利于外植體的再生培養。

3.3 不同激素配比對外植體生芽及生根的影響

不同激素配比是影響番茄外植體再生的重要因素之一，有關番茄離體培養激素調控方面的研究一直在進行。王月等以番茄子葉和下胚軸為外植體進行離體培養，篩選出ZR與IAA的組合最有利于愈傷組織和不定芽的形成，添加IBA的培養基利于誘導不定芽生根［8］；而喬永旭則認為，IAA與6-BA的組合有利于番茄外植體不定芽的生長，而生根培養基中添加的則是IAA［9］，畢建水等的實驗得到相同的結論［10］。本試驗的研究中也發現IAA與6-BA的組合比NAA與6-BA的組合更有利于番茄外植體再生芽的誘導，同時，IAA誘導不定芽生根的作用也比NAA更顯著。這一現象表明，番茄外植體誘芽的最佳激素組合有基因型依賴性，不同的品種其再生的條件不同。要建立適合當地氣候的番茄品種的再生體系，必須對其再生體系進行進一步的探索。

3.4 再生植株的馴化和移栽

如2.3部分中再生植株移栽過程，可有利于保持再生植株的濕度，相對于直接移栽到營養土中的植株更易成活，4 d后，再生植株移栽到營養土中。移栽時試管苗的高度一般在6～10 cm，過高過低都不適合移栽，根系的發育程度是移栽成功與否的決定因素，移栽時應盡量選擇根系較發達的再生植株。

3.5 形成再生植株的周期及效率

本試驗誘導愈傷組織和芽分化都在同一培養基中進行，建立了高效的番茄再生體系，子葉在最佳培養基中誘導不定芽和根的效率分別達到了97%和96%。有些報道也可以得到高達95%以上的再生率，但是，這些報道有的是經過愈傷組織誘導不定芽［9－11］，有的統計分化不定芽率時間較長［8，12］，這樣從接種外植體到植株移栽大概需要70～85 d的時間。本研究中，子葉外植體在最適宜的6-BA和IAA組合上從接種外植體到轉移至生根培養基約需35 d，芽誘導生根約需15 d，再生苗鍛煉5～7 d后移栽，誘導產生再生植株的整個過程約需55 d，加快了再生植株的形成過程縮短了周期，同時提高了再生效率，為番茄快速繁殖和轉基因研究奠定了基礎。

［1］何秀霞，陸一鳴，白杰英，等.番茄組織培養體系的建立及其影響因素的研究［J］.內蒙古民族大學學報（Journal of Inner Mongolia University for Nationalities），2003，18（1）：30-33.

［2］李鐵松，王關林.番茄外植體誘導直接分化不定芽建立高頻再生系統［J］.遼寧師范大學學報（Journal of Liaoning Normal University），2003，26（2）：178-182.

［3］朱廣廉.植物組織培養中的外植體滅菌［J］.植物生理學通訊（Plant Physiology Communications），1996，32（6）：444-449.

［4］梁美霞.番茄子葉和下胚軸離體再生體系建立［J］.中國農學通報（Chinese Agricultural Science Bulletin），2010，26（6）：47-50.

［5］尹明安，郭 立，劉華偉，等.番茄ZF遺傳轉化再生體系的研究［J］.西北農林科技大學學報（Journal of Northwest A＆F University），2002，30（5）：27-30.

［6］歐陽波，李漢霞.番茄下胚軸轉化獲得轉基因植株［J］.華中農業大學學報（Journal of Huazhong Agricultural University），2002，21（3）：206-209.

［7］陳火英，張建華，鐘建江，等.番茄下胚軸離體培養植株再生及其組織學觀察［J］.西北植物學報（Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica），2000，20（5）：759-765.

［8］王 月，郭 鳳，林 英.Micro-Tom番茄離體再生條件的選擇［J］.北方園藝（Northern Horticulture），2010（18）：139-141.

［9］喬永旭.番茄再生體系的建立［J］.北方園藝（Northern Horticulture），2010（17）：174-176.

［10］畢建水，李翠翠，徐麗麗.培養基和繼代時間對番茄葉片愈傷組織誘導和芽分化的影響［J］.安徽農學通報（Anhui Agricultural Science Bulletin），2008，14（13）：41-42.

［11］蔣素華，顧東亞，崔 波，等.番茄真葉愈傷組織誘導及植株再生研究［J］.北方園藝（Northern Horticulture），2009（10）：113-114.

［12］張艷芳，霍秀文，蘇彩霞，等.番茄遺傳轉化體系的建立［J］.農業生物技術學報（Journal of Agricultural Biotechnology），2008，24（3）：58-61.

Establishment of highly efficient regeneration system of tomato

QIU Yan，LIU Hong-xiao，YANG Song－ye
（College of Bioscience and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018，China）

The effects of medias containing different concentration of IAA and 6-BA or NAA and 6-BA on tomato callus induction，bud differentiation and rooting were detected in hypocotyl and cotyledon of Zhenmu No.1.The results show that MS＋0.2 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA is the best medium for callus induction and bud differentiation of cotyledon；MS＋0.5 mg／L IAA＋1.0 mg／L 6-BA is the optimum medium for callus induction and bud differentiation of hypocotyl；the optimum root induction medium is MS＋0.1 mg／L IAA.

tomato；cotyledon；hypocotyl；plant regeneration

S641.2

A

1008-1542（2012）01-0083-06

2011-05-27；

2011-11-09；責任編輯：王海云

河北省自然科學基金資助項目（C2010000860）

仇 燕（1977-），女，河北井徑人，副教授，博士，主要從事植物種質創新方面的研究。