東北鐵線蓮總多酚的超聲提取工藝研究

王曉林，鐘方麗，孫 威，王慧竹

（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林 132022）

東北鐵線蓮總多酚的超聲提取工藝研究

王曉林，鐘方麗，孫 威，王慧竹

（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林 132022）

探索超聲波輔助提取東北鐵線蓮總多酚的最佳工藝條件。以東北鐵線蓮總多酚的提取率作為評價指標，選擇乙醇體積分數、提取時間、料液比、提取次數為考察因素，采用正交試驗法確定了東北鐵線蓮中總多酚的最佳工藝，采用分光光度法對提取液中總多酚的含量進行了測定，檢測波長為766 nm。結果表明：最佳提取工藝條件中乙醇濃度為55%（體積分數），提取時間為35 min，料液比（質量比）為1∶30，提取次數為3次。沒食子酸在質量濃度為1.116～11.160μg／m L時呈現良好的線性關系。該提取方法操作簡單，結果比較可靠，適用于東北鐵線蓮總多酚的提取。

東北鐵線蓮；總多酚；超聲提取；正交試驗法；沒食子酸

東北鐵線蓮（ClematisManshuricaRupr.）是毛茛科鐵線蓮，屬多年生蔓生草本植物，別名辣蓼鐵線蓮、山辣椒秧子，其干燥根及根莖入藥，藥材名為威靈仙，廣泛分布于中國東北三省［1－2］。威靈仙為傳統常用中藥之一，化學成分復雜，藥理作用廣泛，具有降壓、降糖、降血清膽固醇、利尿、抗菌、抑菌、鎮痛、抗炎、解痙、抗腫瘤、利膽等作用［3－5］，常用于風寒濕痹、關節不利、四肢麻木、扁桃體炎及食道癌等疾病的治療［6－7］。植物多酚具有較強的抗氧化作用以及明顯的抑菌、抗癌、抗老化和抑制膽固醇升高等功效。超聲波輔助提取是一種新的萃取技術，具有提取時間短、提取效率高、能耗低等優點，被廣泛應用于天然香料、植物酶、中草藥活性成分等的提取［8］。筆者以東北鐵線蓮總多酚的提取率為評價指標，采用單因素、正交試驗法優化了超聲輔助提取東北鐵線蓮總多酚的工藝條件，為進一步利用和研究東北鐵線蓮提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JBT／C-YCL型超聲波藥品處理機（山東濟寧金百特電子有限責任公司提供）；R-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠提供）；W5-100SP型恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司提供）；BS-600L型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司提供）；752N型三用紫外分析儀（上海精密科學儀器有限公司提供）；RT-08型多功能粉碎機（臺灣榮聰精密科技有限公司提供）。

1.2 材料

沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用）；東北鐵線蓮（安徽省亳州市華申藥業有限公司提供）；東北鐵線蓮的干燥根（經吉林化工學院化學與制藥工程學院藥學系薛健飛博士鑒定為毛茛科鐵線蓮屬）；無水碳酸鈉，鎢酸鈉，鉬酸鈉，硫酸鋰，乙醇等，所用試劑均為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 總多酚含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品2.79 mg，置于50 m L棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解，并定容至刻度，即得沒食子酸對照品溶液（1 m L溶液中含沒食子酸0.055 8 mg）。

2.1.2 供試品溶液的制備

取干燥后的東北鐵線蓮粉末2.5 g，稱定，置于錐形瓶中，加50%（體積分數）乙醇適量，超聲提取2次，超聲溫度為40℃。過濾，合并濾液，濃縮，冷卻，定容至50 m L的容量瓶中，搖勻。吸取1.0 m L，置于50 m L容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.1.3 Folin-Cioealteu試劑（磷鉬鎢酸試液）的制備

在圓底燒瓶中加入鎢酸鈉50 g，鉬酸鈉12.5 g，蒸餾水350 m L，濃磷酸25 m L，濃鹽酸50 m L，充分混勻，水浴回流10 h。再加入硫酸鋰75 g，蒸餾水25 m L，溴水數滴，開口繼續沸騰15 min，使溴水揮發完全為止。冷卻，過濾，定容至500 m L棕色容量瓶中。將此溶液置于冰箱中保存，使用時加入1倍體積的蒸餾水。

2.1.4 檢測波長的選擇

取供試品溶液及對照品溶液各5 m L，放入50 m L容量瓶中，用水稀釋至刻度，再吸取此溶液5 m L，置于25 m L容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。取該溶液1.0 m L，置于10 m L的容量瓶中，加4 m L蒸餾水，再加入磷鉬鎢酸試液1.0 m L，用29%（質量分數）的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應的試劑為空白，在波長400～800 nm范圍內進行掃描，結果發現二者最大波長均為766 nm，故確定檢測波長為766 nm。

2.1.5 分析方法

精確量取1.0 m L樣品溶液，放入10 m L容量瓶中，加4 m L蒸餾水，再加入磷鉬鎢酸試液1.0 m L，用29%（質量分數）碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。按照分光光度法，在766 nm波長處測定其吸光度［9］。

2.1.6 線性關系考察

精確吸取沒食子酸對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 m L，放入25 m L容量瓶中，加適量蒸餾水，再分別加入磷鉬鎢酸試液1.0 m L，用29%（質量分數）碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。以相應的試劑為空白，在766 nm波長下測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，沒食子酸質量濃度ρ為橫坐標繪制標準曲線，求得回歸方程為A＝0.086 28ρ＋0.029 19，R＝0.999 5。

2.1.7 精密度實驗

取標準曲線項下質量濃度為0.004 64 mg／m L的對照品溶液，按“2.1.5”所述方法，連續測定5次吸光度，得知RSD值為0.13%（n＝5），結果表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩定性實驗

取供試品溶液，分別于配制后的0，30，60，120，180，240 min，按“2.1.5”所述方法測定吸光度。結果表明，供試品溶液在30 min內穩定，然后穩定性下降，但在60～180 min時吸光度值比較穩定，所以供試品溶液配制完成后應盡快進行吸光度的測定。

2.1.9 重現性實驗

取同一批號的藥材粉末5份，按“2.1.2”所述方法制備，按“2.1.5”所述方法進行測定，得知RSD值為1.65%（n＝5），結果表明該方法重現性良好。

2.1.10 加樣回收率實驗

精密稱取已知質量分數（5.56%）的樣品各0.5 g，共5份，精密加入沒食子酸對照品27.6 mg，按“2.1.2”所述方法制備，按“2.1.5”所述方法進行測定，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率測定結果Tab.1 Experimental results of recovery test

2.2 正交試驗優選東北鐵線蓮總多酚超聲輔助提取工藝

2.2.1 因素及水平考察

通過單因素探索試驗，分別對料液比（質量比）（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50），提取時間（10，20，30，40，60 min），提取次數（1，2，3，4，5），乙醇體積分數（30%，50%，60%，75%，90%）等因素和水平進行了探索。以東北鐵線蓮總多酚的提取率作為評價指標，確定較好的提取因素與水平如下：料液比為1∶20，提取時間為30 min，提取次數為3次，乙醇體積分數為50%。單因素探索結果可作為確定正交試驗因素與水平數的重要依據。根據單因素探索性試驗結果，選擇提取次數、料液比、提取時間和乙醇體積分數4個因素，每個因素選擇3個水平，設定因素水平表，見表2。

表2 因素及水平表Tab.2 Table of factors and levels

2.2.2 提取方法

取東北鐵線蓮粉末2.5 g，按L9（34）正交試驗表設計方案進行試驗，加入一定體積分數的乙醇進行提取，合并提取液，過濾。將濾液濃縮至50 m L，按“2.1.2”所述方法制備供試品溶液，按“2.1.5”所述方法測定提取液中總多酚的含量，進而得出提取的總多酚的質量和總多酚提取率，總多酚提取率＝總多酚質量／東北鐵線蓮藥粉質量×100%。正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果Tab.3 Results of orthogonal experiments

以東北鐵線蓮總多酚的提取率為指標，根據正交試驗結果，由表3可知適宜的實驗條件為A3B3C3D3。因為所有的因素水平均為最高點，故不能確定所得實驗條件是否為最佳條件，通過補充實驗進行驗證。由于單因素實驗結果已表明提取3次已將東北鐵線蓮中總多酚提取完全，所以提取次數固定為3次，由于其他條件均為最高點，故每個因素均進行第4水平實驗，即乙醇體積分數為60%，其他3個因素都用最佳實驗條件；提取時間為40 min，其他3個因素都用最佳實驗條件；溶劑用量為35倍，其他3個因素都用最佳實驗條件。實驗結果見表4。

表4 補充實驗結果Tab.4 Results of supplementary experiments

結果表明，第4水平實驗并未明顯提高東北鐵線蓮中總多酚的提取率。所以確定東北鐵線蓮中總多酚的最佳提取條件如下：料液比（質量比）為1∶30，提取時間為35 min，提取次數為3次，乙醇體積分數為55%。

2.2.3 工藝驗證性實驗

為了驗證實驗所得的最佳工藝條件的穩定性，按優化工藝條件進行3次驗證性實驗，然后各取30 m L提取液，倒入稱重后的蒸發皿中水浴蒸干，基本蒸干后放入電熱鼓風干燥箱中干燥，待其干燥至恒重后稱重，由差值得到浸膏質量，計算干浸膏總多酚的含量，結果見表5。實驗結果表明：東北鐵線蓮中總多酚的提取率分別為5.55%，5.56%，5.33%，平均提取率為5.48%，干浸膏中總多酚的質量分數分別為23.48%，23.49%，22.53%，平均質量分數為23.17%。這表明優化的工藝條件重現性高，穩定可靠。

3 討 論

3.1 料液比、提取時間、乙醇體積分數的選擇

單因素實驗中料液比（質量比）分別設定為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，提取時間分別設定為5，10，20，30，40，60 min，乙醇體積分數分別設定為30%，50%，60%，75%，90%。結果表明：料液比（質量比）為（1︰20）～（1︰40）時，總多酚提取率較高且比較穩定；提取率隨提取時間的延長而增加，在30 min時提取率最高；乙醇體積分數為50%時提取率最高。所以在正交試驗中選擇料液比（質量比）為1∶20，1∶25，1∶30，提取時間為25，30，35 min，乙醇體積分數為45%，50%，55%，進一步考察各因素對提取效果的影響。

3.2 提取次數的選擇

單因素實驗中提取次數的考察按如下方案進行：稱取東北鐵線蓮藥材粉末約2.5 g，量取20倍量50%（體積分數）的乙醇，分別提取1，2，3，4，5次，每次超聲（40℃）30 min，過濾。把每次的濾液定容至50 m L的容量瓶中，按“2.1.2”所述方法制備供試品溶液，按 “2.1.5”所述方法測定提取液中總多酚的含量，進而得出提取的總多酚質量和總多酚提取率。結果表明：提取3次可以將東北鐵線蓮總多酚提取完全，其中前2次即可提取總量的89%。

4 結 語

通過正交試驗法對東北鐵線蓮總多酚的超聲輔助提取工藝條件進行了優化，并按最佳工藝進行了驗證試驗。結果證明，該工藝提取東北鐵線蓮總多酚路線簡單、提取率高、操作容易控制、穩定性好，為東北鐵線蓮總多酚提取的工業生產提供了合理依據。

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Study on extraction technology of total polyphenols inClematisManshuricaRupr.

WANG Xiao-lin，ZHONG Fang-li，SUN Wei，WANG Hui-zhu
（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin Jilin 132022，China）

This paper is to establish the optimum extraction technology of total polyphenols（TP）inClematismanshurica Rupr.by ultrasonic extraction method.By using the extraction efficiency of TP inClematismanshuricaRupr.as evaluating indicator，some important factors，such as the concentration of ethanol，the extracting time，the ratio between raw material and solvent and the extracting times，are optimized by orthogonal experimental design.The content of TP inClematismanshurica Rupr.is determined by spectrum photometric method at detection wavelength of 766 nm.The optimum extraction condition of TP inClematismanshuricaRupr.with ultrasonic method are obtained as follows：the concentration of ethanol，the extracting time is 35 min，the ratio of raw material to solvent is 1∶30，and the extraction times is 3 times is 55%.The concentration of gallic acid and its absorption value shows a good linear relationship at the range of 1.116～11.160μg／m L.It is concluded that the ultrasonic extraction method obtained in the paper is easy to operate and reliable，so it could be used for extracting TP inClematismanshuricaRupr.

ClematisManshuricaRupr.；total polyphenols（TP）；ultrasonic extraction；orthogonal experimental design；gallic acid

R282.71

A

1008-1542（2012）01-0032-04

2011-08-31；

2011-11-16；責任編輯：張士瑩

王曉林（1969-），男，山東五蓮人，副教授，碩士，主要從事天然產物有效成分的提取及純化工藝方面的研究。

鐘方麗教授。E-mail：fanglizhong＠sina.com