量子點-Cu2+對L02細胞的聯合毒性及NAC的防護作用

趙宇俠,林匡飛,張 衛,劉莉莉 (.淮海工學院化工學院環境工程系,江蘇 連云港 005；.華東理工大學資源與環境工程學院,國家環境保護化工過程環境風險評價與控制重點實驗室,上海 0037)

量子點-Cu2+對L02細胞的聯合毒性及NAC的防護作用

趙宇俠1,林匡飛2*,張 衛2,劉莉莉2(1.淮海工學院化工學院環境工程系,江蘇 連云港 222005；2.華東理工大學資源與環境工程學院,國家環境保護化工過程環境風險評價與控制重點實驗室,上海 200237)

以人胚肝細胞(L02)為研究對象,通過研究量子點及Cu2+(低毒濃度)聯合對細胞存活率的影響以及細胞形態的變化確認細胞的毒性,結合抗氧化劑NAC的防護效果探討復合毒性的氧化損傷機理.結果表明,無論單獨Cu2+還是量子點-Cu2+處理組,L02細胞的增殖能力均受到抑制,量子點-Cu2+處理組表現出更加顯著的抑制效果,相對與單獨Cu2+處理組細胞存活率最大下降300%.經過NAC預處理的細胞在形態和存活率上都顯著恢復.說明了安全濃度范圍的量子點的與Cu2+共存提高了細胞毒性風險,NAC能夠防護量子點與Cu2+單獨或聯合引起的氧化損傷.

CdTe-MPA量子點；Cu2+；L02細胞；MTT；聯合毒性

量子點(QDs)是近年發展起來的一種新型熒光納米顆粒,也稱半導體納米微晶體,是一種由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的納米顆粒.由于其粒徑很小(約 2～10nm),電子和空穴被量子限域,連續能帶變成具有分子特性的分立能級結構,與傳統的有機熒光染料相比,量子點的具有激發光譜寬,發射光譜窄而對稱,顏色可調,光化學穩定性高,不易光解等獨特的光學性質.目前,量子點最具前景的應用是在生物和醫學領域中作為熒光標記物[1-5],它不僅可以在體外用于細胞骨架的標記,還可以用于生物體內的熒光成像[6-7].量子點越來越廣泛應用使得其生物安全性的研究引起人們的廣泛關注.關于量子點的毒性機制研究主要集中在量子點高活性表面以及核心 Cd2+的釋放所產生的活性氧自由基介導的氧化應激等方面[5-11].

重金屬銅存在于各種巖石和礦物中,是生物體自身所必需的元素.銅元素可以以3種氧化態互相轉化Cu0、Cu+、Cu2+,銅存在于30多種酶中作為氧化還原催化劑或氧載體,能夠通過 Fenton反應在過氧化氫存在的條件下催化羥基自由基的生成[12-13].羥基自由基是毒性很強的自由基,能夠通過與脂類,氨基酸,和巰基,RNA,DNA等反應導致細胞損壞甚至死亡[12].

量子點和銅不僅都會通過 ROS產生毒性,并且在生物體內往往都在肝中蓄積[14-15],通常對于銅污染采用的有效的3種主要方法包括絡合、沉淀和吸附[16].天然水中,OH-與銅絡合形成銅的水解產物 Cu(OH)+、Cu(OH)20、Cu2(OH)22+[16];這就使得量子點的加入對原有銅的毒性存在 2種可能,一是基于共同機制的 ROS損傷,另外可能由于量子點對銅可能的吸附和表面羥基的絡和降低其毒性.這種復合毒性無論對環境還是對體內蓄積的共存都存在影響,乙酰半胱氨酸NAC作為著名的抗氧化劑可以通過屏蔽掉相關的氧化損傷減少細胞毒性[17],進而從反面證明細胞的毒性機理.

基于以上考慮,本研究就量子點和Cu2+的聯合毒性進行實驗,考察量子點的加入對銅離子的毒性的影響,驗證上述假設.同時通過抗氧化劑NAC驗證是否ROS增加是毒性的主導因素,以期為其可能的體內和環境風險提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗所用的人胚肝細胞(L02)購自中國科學院細胞庫,量子點 CdTe-MPA(巰基丙酸)由華東理工大學化工學院合成,包覆MPA.直徑為3.7nm發紅光,在水相中合成的發射波長為628nm,摩爾濃度為5.8×10-6mol/L,質量濃度為0.64mg/mL在pH值6～12范圍內穩定,合成方法參見參考文獻[2].量子點合成后用收集離心用丙醇純化以去除雜質.RPMI-1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司.除了特別指出,其他所用的試劑包括無水氯化銅,乙酰半胱氨酸 NAC(N-ace tylcystein),四甲基偶氮唑鹽(MTT),2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)都購自Sigma試劑公司(St. Louis, MO, USA).

1.2 量子點和Cu2+處理及NAC保護實驗

[8]的方法,實驗用的 L02細胞用RPMI-1640培養基(GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)加入 10%的胎牛血清 (FBS) (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)在37℃濕度是95%和5%的CO2條件下培養.細胞在96孔板上以(細胞數) 104個/mL的初始濃度培養,用于分析細胞內Cu2+濃度的實驗使用的是12孔板和細胞初始濃度是104個/mL.細胞處理前1 h,含有血清的培養基吸出,細胞PBS緩沖液洗2遍后替換上新鮮的無血清培養基[17].

細胞用不同濃度的單獨的或聯合的量子點(2～20μg/mL)與Cu2+(2～320μg/mL)處理,培養24h后用于各項分析.NAC的保護作用實驗選擇10μmol/L的NAC提前2h時加入培養基,然后替換為新鮮的含污染物的培養基處理24h后,再通過測定細胞存活率和觀察細胞形態等來考察NAC的防護效果從而推測其損傷機理.QDs從10mg/mL的無血清的培養基配制的母液稀釋得到,CuCl2從無菌的超純水配置的30mg/mL的母液稀釋得到.

1.3 MTT法測定細胞存活率

活細胞線粒體可還原MTT為紫色的甲瓚結晶,在一定范圍內紫色深淺與活細胞濃度呈線性關系,通過測定甲瓚 570nm波長處的吸光值可反映活細胞活力的變化.取對數生長期細胞接種于 96孔培養板(1×104個/mL),培養 24h使細胞貼壁,棄培養液,每孔加入含量子點或Cu2+的培養基稀釋的濃度分別為 0,2.5,5,10,20, 40,80,160μg/mL的Cu2+,和0,2.5,5,10,20,40,80, 160μg/mL的量子點溶液,每個劑量組設定3個復孔.染毒 24h后棄去每孔中的培養液,加入含10% MTT(5mg/mL)的RPMI-1640培養基(不含胎牛血清),繼續培養4h后,棄去MTT溶液,每孔加入DMSO 150μL后,于37℃振蕩至紫色的甲瓚結晶完全溶解后用酶標儀測定各孔在570nm波長處的吸光度值.確定量子點和 Cu2+對L02細胞的半致死濃度[8,17].

對于聯合毒性實驗方法如上,量子點選擇了2μg/mL(24h細胞致死率 10%)和 2.5,5,10, 20μg/mL濃度的Cu2+,進行了Cu2+單獨處理和量子點-Cu2+聯合處理的細胞存活率實驗.同樣在無血清的培養基中處理 24h后替換 MTT在570nm波長處測定了吸光度值.確定量子點的存在對Cu2+細胞存活率的影響.

1.4 細胞形態學觀察

將待測試細胞接種于 6孔板(內置蓋玻片),培養 24h,待細胞貼壁后,分別加入各種濃度受試物,處理 24h,將蓋玻片取出,用細胞固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定 5min,蒸餾水稍洗后加HE (蘇木精-伊紅)染色 10min,洗片后風干,倒置顯微鏡(IMT-2, Olympus, Tokyo)下觀察細胞形態學變化[8].

1.5 統計分析

數據以均數±標準差(x±s)表示,應用 Origin 7.5軟件對數據進行單因素方差分析和T-test檢驗,*表示以P＜0.05置信度下的差異有顯著性,代表 QDs-Cu2+聯合處理樣品對單獨 Cu2+處理的差異顯著.

2 結果與分析

2.1 量子點與Cu2+對L02細胞毒性的LC50值

由圖 1可知,不同濃度的量子點和 Cu2+處理 24h后,隨著染毒劑量的增大,細胞增殖能力明顯下降,呈劑量-效應關系.量子點對L02細胞的半致死濃度 LC50為 20μg/mL,LC10值約為2μg/mL. Cu2+對 L02細胞的半致死濃度約為31.3μg/mL.

2.2 量子點的加入對Cu2+細胞毒性的影響

為了調查低毒的量子點對原有的污染物Cu2+的影響, Cu2+選擇在LC50范圍內選擇4個濃度 2.5,5,10,20μg/mL,量子點選擇 LC10(2μg/mL)進行聯合毒性試驗.比較量子點與 Cu2+聯合組與單獨Cu2+處理組的細胞增殖情況(表1).結果表明, LC10濃度量子點的加入能顯著提高Cu2+的毒性.除了2.5μg/mL濃度外,選定的其他濃度Cu2+的半致死濃度都被提高到LC50濃度以上,最高增加了3倍.

2.3 NAC的防護作用

由于量子點和 Cu2+的毒性機理都與氧化損傷有關,為了驗證2種污染物質是否通過相同的路徑誘導產生細胞毒性,考察了 NAC對單獨和聯合損傷的防護效果.NAC作為有效的抗氧化劑已經被證明能夠有效的防護重金屬或者納米材料誘導的氧化損傷[17-18].如果 2種污染物質通過共通的氧化應激路徑來實現對L02細胞的損傷,預期NAC能夠進行有效的防護.

圖1 量子點和Cu2+ 對L02細胞存活率的影響Fig.1 Effect of QDs and Cu2+ on L02 cells viability

表1 量子點對Cu2+誘導的細胞毒性的影響Table 1 Effect of QDs on Cu2+ induced cell viability decrease

圖2 NAC對Cu2+和QDs-Cu2+誘導的細胞毒性的影響Fig.2 Effect of NAC on Cu2+and QDs-Cu2+ induced cell viability loss

如果兩者通過其他的損傷路徑造成對細胞的傷害,那么 NAC至少不能夠實現全面防護.選擇10μmol/L的NAC提前2h加入培養基,然后替換為新鮮的含污染物的培養基處理24h后,再測定細胞存活率.根據MTT結果考察NAC的防護效果從而推測其損傷機理[8].

結果表明,NAC幾乎能夠有效的恢復Cu2+單獨處理組或者量子點與 Cu2+聯合處理組的細胞存活率損失.在調查濃度范圍內,NAC顯著地提高了污染物帶來的L02細胞的增殖能力的下降,結合前面的研究證明的量子點的加入顯著提高了Cu2+誘導的L02細胞ROS的產生水平(最高提高400%)[19],說明量子點與原有的污染物Cu2+的主要損傷路徑是通過氧化脅迫來實現的.

2.4 細胞形態學觀察

通過 HE染色觀察各處理組的細胞形態變化(圖3),基本和MTT結果一致.相對與Cu2+處理組來說,量子點的加入使細胞呈現了更加明顯的傷害.在鏡下觀察可見活細胞數明顯減少,細胞間質消失,細胞體積縮小,細胞核濃縮、靠邊、深染等各種不同程度的異常變化.NAC處理后的細胞則無論在數量還是在形態都得到了顯著的回復,細胞形態正常化.

圖3 不同處理濃度下單獨或者聯合處理組的細胞形態染色Fig.3 Effect of NAC on Cu2+ and QDs-Cu2+ induced cell morphology changes

3 討論

無毒的量子點(LC10)的存在使得原本低毒的 Cu2+(LC50以下)毒性顯著提高.這一結果同Wilson等關于過渡金屬和超細粉末的聯合氧化損傷是一致的[20].也就是說當量子點和Cu2+共存于環境中時并沒有由于可能的結合帶來毒性的減弱,而是由于共通的氧化損傷帶來了毒性的增強.當多種量子點和重金屬毒物共存于污染水體中時,將出現復雜的聯合毒性效應,所以僅用各種納米材料或者重金屬單一毒性的污染指標判斷水污染后的毒性是不可取的.還應從聯合毒性的角度采用生物毒性試驗方法對水質污染作出較客觀的綜合評價.

此外,由于納米技術的產業化,以及納米材料在醫療診斷、材料改性、環境污染物降解以及生物技術等領域的廣泛應用[5,21],不可避免地會帶來由于生產增加而帶來的環境排放量的增加[14].而且由于其在細胞無損傷的實時成像、藥物運送等方面的應用可能帶來量子點的體內蓄積,Yang等[22]也證明了量子點在體內會重新再分配并且主要在肝中蓄積[22].同樣Cu2+作為原生的環境污染物由于工業和自然地理的原因在造成環境污染,并且作為人體必需的元素也主要是富集在肝臟[23].所以無論量子點和Cu2+在環境中或者由于醫療作用等原因在體內共存并且由此帶來復合傷害的危險都存在.這就使得對于復合污染尤其是對于單獨污染評價認為是安全基礎上的復合毒性的評價和相應的機理以及防護措施的研究等尤其必要.

關于量子點的毒性機制研究主要集中在重金屬元素Cd2+的釋放、氧化過程中活性氧的產生以及活性氧自由基介導的氧化應激等方面的探討[5],關于銅的致毒機理有很多,也包括活性氧自由基介導的氧化應激[24]以及通過激活AP-1轉錄和 JNK/SAPK及p38轉導等路徑實現.NAC作為有效的ROS防護劑能夠有效的防止氧化損傷證明了2種污染物能夠通過共通的氧化損傷路徑來實現對肝細胞的致毒效應.

氧化應激使機體處于易損狀態,它不僅與多種疾病的發生發展有關,此外尚有資料表明活性氧可啟動一個鏈式反應,易與細胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應,這種直接作用于細胞的氧化損傷能導致從而導致細胞脂質過氧化水平升高,引起 DNA氧化損傷,細胞凋亡[26].所以考察NAC作為抗氧化劑是否提供有效的防護作用具有現實意義.也就是說可以為可能與量子點有關的環境污染或者體內毒性提供合理的解決路徑.

4 結論

4.1 量子點和Cu2+的加入都會對L02細胞產生毒性.兩者的LC50分別為20μg/mL和31.3μg/mL并且該毒性都與氧化損傷有關.NAC能夠有效的防護量子點和 Cu2+單獨作用或者聯合作用誘導的細胞毒性.

4.2 無毒的量子點(LC10)的加入顯著提高Cu2+(LC50以上)的毒性,使得 Cu2+半致死濃度由31.3μg/mL降為3.83μg/mL.表明了無毒的量子點與無(低)毒的環境污染物的共存可能造成潛在的毒性效應和環境風險.

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Combined toxicity of QD-Cu2+on L02 cells and protective effect of NAC.

ZHAO Yu-xia1, LIN Kuang-fei2*, ZHANG Wei2, LIU Li-li2(1. School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology,Liangyungang 222005, China; 2.Research Center of Risk Assessment and Management on Hazardous Chemicals, School of Resource and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China). China Environmental Science, 2012,32(1)：162～167

The oxidative injury of individual QDs or Cu2+to hepatic cells were both reported, the combined toxicity is concerned due to the co-existence of these two chemicals in human liver. We thus employed human hepatic L02 cells to test the combined toxicity of QDs and Cu2+(lower toxicity) through the cell viability decrease and cell morphology changes, meanwhile, the protective effect of antioxidant reagent NAC was used to evaluate the oxidant injury associated toxicity mechanism. The results showed that both QDs and Cu2+could decrease the cells viability, and addition of IC10of QDs could significantly improve Cu2+induced cell toxicity with cell viability decrease up to 300 %. NAC showed remarkable protective effects with almost identical cell viability and cell morphology compared to the control, indicating the coexistence of lower toxicity of QDs could improve Cu2+induced L02 cells toxicity, and NAC could effectively decrease QDs-Cu2induced oxidant injury toxicity.

CdTe-MPA quatum dots；Cu2+；L02 cells；MTT；combined toxicity

2011-03-11

國家自然科學基金資助項目(40901148,41001316);淮海工學院自然科學基金項目(kx10516);連云港市科技局農業攻關項目(NY1007)

* 責任作者, 教授, kflin@ecust.edu.cn

X171.5

A

1000-6923(2012)01-0162-06

趙宇俠(1974-),女,吉林農安人,講師,博士,研究方向為環境毒理學和環境微生物.發表論文10余篇.