正交實驗選擇纖維素酶產生菌的最優綜合培養條件

黃蓉姿,萬金泉,馬邕文,黃明智,3,楊漪清 (.華南理工大學環境科學與工程學院,廣東 廣州 50006；2.華南理工大學工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室,廣東 廣州 50006；3.華南理工大學化學與化工學院,廣東 廣州 5064)

正交實驗選擇纖維素酶產生菌的最優綜合培養條件

黃蓉姿1,2,萬金泉1*,馬邕文1,黃明智1,3,楊漪清1(1.華南理工大學環境科學與工程學院,廣東 廣州 510006；2.華南理工大學工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室,廣東 廣州 510006；3.華南理工大學化學與化工學院,廣東 廣州 510641)

在復合碳源、30℃恒溫培養條件下,用正交實驗法對影響纖維素酶產生菌降解纖維素的 5種單因素培養條件進行了優化,并將優化得到的條件應用于厭氧-好氧廢水處理系統.結果表明,MgSO4用量等單因素對纖維素酶活性以及纖維素降解率有不同程度的促進作用;正交實驗得到厭氧菌和好氧菌的最佳培養條件不完全一致;在廢水處理系統中,5種單因素的最佳綜合水平為:30mg/L MgSO4,20mg/L CoCl2,CNP配比為400:5:1,氮源為NH4Cl (28.7mg/L), pH=7.0,此時厭氧菌及好氧菌酶活性分別為4801U/L和4794U/L,酶穩定性分別達到91.0%和95.5%,纖維素降解率為31.9%和28.4% .

正交實驗；酶活性；酶穩定性；纖維素降解率

造紙行業會產生大量含纖維素的廢水,機械過濾只能去除其中不溶解的、粒徑較大的雜質,仍有一些細小纖維進入后續的生物處理過程中[1].生物處理可以有效降低纖維素廢水的污染物負荷,提高廢水的可生化性[2].纖維素的生物降解依賴于纖維素酶產生菌的生理過程,受系統環境因素影響很大[3],因此尋找最佳的產酶條件成了眾多學者關注的問題.但目前纖維素酶在環境領域的研究主要集中在降解固體廢物中的纖維素方面[4-5],很少見到纖維素酶在廢水處理系統中的報道.

為了強化造紙廢水細小纖維的生物降解過程,縮短廢水處理周期,本研究在以前選定的碳源和溫度條件[6]下,考察另外 5種單因素綜合培養條件下對纖維素酶產生菌的調控作用,包括MgSO4用量、CoCl2用量、CNP配比、氮源組成以及pH值等.由于影響因素較多,通過設計正交實驗 L16(45),在一定程度上避免了選擇最佳培養條件的盲目性.

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗采用的厭氧菌和好氧菌為復合菌,取自實驗室生物掛膜的厭氧-好氧折流式工藝反應器裝置.接種污泥取自廣州市獵德污水處理廠的二沉池,馴化期間采用葡萄糖和纖維素廢水混合作為基質[7].

基礎培養溶液為:葡萄糖(第 1碳源): 600mg/L,少量 NaHCO3、CaCl2、MnSO4、Fe2(SO4)3、ZnCl2等無機鹽.以上述溶液為基礎,依據正交實驗分配分別加入不同組分或改變某些組分的用量(表1),配成不同正交組液體培養基.

表1 各因素的水平列表Table 1 List of factors’ levels

微晶纖維素(MCC),購于國藥集團化學試劑有限公司,粉碎過200目篩.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 采用2個為一組的200mL搖瓶模擬厭氧-好氧反應器,每隔12h更新各搖瓶中的培養液,厭氧瓶的用基礎培養基進行更新,好氧瓶的用停留厭氧瓶12h后的培養基進行更新.各搖瓶裝40mL培養液、100mg微晶纖維素(第2碳源),將20mL厭氧或好氧菌懸液接種于對應的培養基,然后置于30℃振蕩培養箱(厭氧108r/min,好氧180r/min)中培養5d ,測定厭氧菌、好氧菌的纖維素酶活性以及纖維素降解率.依照 5因素 4水平正交實驗的設計(表2),共有16組厭氧-好氧實驗,均做平行實驗.

將正交實驗優化得到的培養條件應用于厭氧-好氧折流式反應器,培養5d,取出生物膜,制成菌懸液,測定系統中厭氧菌、好氧菌的纖維素酶活性、酶穩定性以及纖維素降解率.

1.2.2 酶活性測定 纖維素的最終酶解產物是葡萄糖,通過測定底物酶解后的葡萄糖生成量來表征纖維素酶活性,本實驗采用離子色譜法測定葡萄糖含量.具體方法為:培養結束后,從各搖瓶中取出上清液,并用 0.22μm的水相濾膜過濾,測定葡萄糖濃度,作為實驗的空白值 C0;另取新的試管,加入5mL培養后的菌懸液、10mg微晶纖維素、5mL檸檬酸緩沖液,在50℃水浴中保溫1h,反應后取出溶液,并用 0.22μm的水相濾膜過濾,測定葡萄糖濃度C.

離子色譜條件:離子色譜儀:DIONEX ICS –3000;分析柱:CarboPac PA1(2@250mm);保護柱: CarboPac PA1 (2@50mm);淋 洗 液 : 0.001molNaOH-0.05molNaAC;體 積 流 量 : 0.500mL/min;進樣體積:10μL;柱溫:30e;檢測器:脈沖安培檢測器,金電極.

1.2.3 纖維素酶活性的定義及計算 纖維素酶活性定義:以底物在50℃,pH4.8,恒溫一定時間的條件下,以水解反應中每克懸浮固體每小時催化底物水解形成 1.0mg葡萄糖的酶量定義為一個活力單位,用U表示.酶活的計算公式為:x = (C –C0)/(MLSS?T),式中:x為纖維素酶活性, U;C為樣品的葡萄糖濃度,C0為空白實驗的葡萄糖濃度,mg/mL;MLSS為混合液懸浮固體濃度,g/mL;T為反應時間,h.

1.2.4 酶穩定性測定 取完成培養的生物膜樣品,制成菌懸液,用甲苯進行滅菌,室溫保存 4h,測定纖維素酶的殘余酶活性,以 0h酶活性為標準(100%)計算相對酶活性.

1.2.5 纖維素降解率測定 參照文獻[8],培養結束后,倒掉上清液,用蒸餾水輕輕洗去菌體,將固形物置于60℃烘箱中烘至恒重,用電子天平分別稱量未被降解的微晶纖維素質量,記為 Wi(g),培養前的微晶纖維素質量記為 W0(g),則降解率η=(W0-W1) /W0×100%.

2 結果與討論

2.1 5因素4水平正交實驗分配與結果

由表 2可見,無論是厭氧段還是好氧段, MgSO4用量、CoCl2用量、CNP配比、氮源組成、pH值5種因素在單因素條件下對纖維素酶產生菌的產酶和降解能力均有一定的促進作用.

表2 5因素4水平正交實驗分配及結果Table 2 Disposition and result of orthogonal experimental design L16(45)

2.1.1 厭氧菌產酶及降解能力 由表 3、表 4可見,厭氧菌產酶及降解效果最佳的實驗條件組合完全一致,均為 A4B4C4D3E2,即:厭氧菌在30mg/L MgSO4、30mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、CO(NH2)2:NH4Cl=1:2的混合氮源、pH6.0時,纖維素酶活性最高,纖維素降解率最大.

根據極差分析各因素對酶活性變化影響大小的順序為MgSO4＞氮源組成＞CoCl2＞CNP配比＞pH值,而對降解率變化的影響順序為MgSO4＞ 氮源組成 ＞ CNP配比 ＞ CoCl2＞ pH值,可見5種因素中,影響厭氧段纖維素酶產生菌生長代謝的主要因素是MgSO4和氮源組成,而pH值對酶活性和降解率影響較小,可能是產纖維素酶的厭氧微生物在這4種pH值條件下生長狀況相似的緣故.何品晶等[9]通過研究pH值對有機垃圾厭氧水解的影響,發現發酵液的pH值為5～7時有利于顆粒態有機物的水解.

表3 厭氧菌酶活性(U/L)Table 3 Enzyme activity of anaerobe (U/L)

表4 厭氧段纖維素降解率(%)Table 4 Degradation-rate of cellulose in anaerobic stage(%)

2.1.2 好養菌產酶及降解能力 由表 5、表 6可見,好氧菌產酶效果最佳的實驗條件組合為A4B3C4D2E3,而 降 解 效果 最 佳 的 組 合 為A4B3C4D3E3,兩者非常接近,僅在氮源組成上有差別,分別為CO(NH2)2: NH4Cl＝0∶3和CO(NH2)2: NH4Cl＝1∶2,其他條件組合為30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、pH=7.0.

各因素對酶活性變化影響的順序為CNP配比 ＞ pH 值＞ CoCl2＞ MgSO4＞ 氮源組成,而對降解率變化的影響順序為CNP配比 ＞ pH 值＞MgSO4＞ CoCl2＞ 氮源組成,可見在5種因素中,影響好氧段纖維素酶產生菌生長代謝的主要因素是CNP配比和pH值.而氮源組成對實驗結果影響不大;同時經F檢驗,氮源組成對酶活性和降解率的影響也不顯著.

表5 好氧菌酶活性(U/L)Table 5 Enzyme activity of aerobe (U/L)

表6 好氧段纖維素降解率(%)Table 6 Degradation-rate of cellulose in aerobic stage(%)

2.1.3 正交實驗各因素的影響 由圖 1、圖 2可見,無論是厭氧菌還是好氧菌,它們各自的因素-指標趨勢基本吻合,即同一因素水平條件下的酶活性與降解率呈現出較好的對應關系,這也說明纖維素類物質的降解主要依靠微生物分泌的纖維素酶進行[10].

金屬離子是微生物生長必不可少的一類營養物質[11],而且厭氧過程中缺乏微量金屬營養元素產生的不利影響比好氧過程要大[12].對比圖 1與圖 2,Mg2+的作用趨勢幾乎相同,都在30mg/L時達到最佳效果;但厭氧菌和好氧菌對于 Co2+的濃度要求存在較大差異,主要是20,30mg/L,說明不同微生物對 Co2+的濃度要求不同.李德瑩等[13]研究金屬離子對纖維素酶活力的影響發現,Mg2+、Co2+離子濃度在一定范圍內,對纖維素酶活性有激活作用,Mg2+、Co2+分別在1.2、0.2mg/mL時,酶活性達到峰值,濃度增大表現出抑制作用.相比之下,本研究金屬離子作用濃度較低.

圖1 厭氧段各因素的作用趨勢Fig.1 Effect of different factors in anaerobic stage

圖2 好氧段各因素的作用趨勢Fig.2 Effect of different factors in aerobic stage

厭氧菌和好氧菌均在400:5:1的CNP配比下生長良好,酶活性和降解率達到較高水平.這個比例與經驗值(厭氧條件下 200:5:1及好氧條件下100:5:1)略有出入,說明微生物對碳源的需求和競爭增大,可能跟系統中的微生物種類有關系,有待進一步的研究.

由圖1、圖2可以看出,氮源組成對厭氧菌影響顯著,對好氧菌影響甚小.但對于氮源組成的要求,兩者都偏向無機氮源比例較大的混合氮源,即CO(NH2)2: NH4Cl＝1∶2.相對來說,無機氮源比有機氮源更好,因為有機氮源同時作為碳源,有可能優先于纖維素被利用,一定程度上妨礙了纖維素的降解[14].殷中偉等[15]、徐昶等[16]通過研究不同氮源對纖維素降解菌產酶的影響發現,以硝酸鹽為無機氮源時酶活力最高.

本實驗得出pH6.0、pH7.0分別適合厭氧菌、好氧菌的生長,在中性偏酸及中性的條件下表現出較高的酶活性和降解能力.pH值通過影響微生物群落結構的變化影響有機物的代謝過程.葉凝芳等[17]通過Shannon指數分析表明,pH 7或8時的微生物多樣性較高.一般情況下,生物多樣性越高,其代謝關系越復雜,結構越穩定,對污染物的協同作用能力也越大[10].何品晶等[9]認為,在pH值為5、6、7、8條件下,微生物處于靜止生長期時,水解速率常數處于同一個數量級,且發酵液pH7時最有利于微生物的合成代謝.

2.2 纖維素降解菌的最優綜合培養條件

由于以上的搖瓶模擬實驗得出厭氧菌產酶及降解效果最佳、好氧菌產酶效果最佳、好氧菌降解效果最佳的3種條件組合(表7),彼此間略有差異,為進一步得到廢水處理系統中纖維素酶產生菌的最優綜合培養條件,將優化得到的3種組合分別應用于厭氧-好氧折流式反應器,考察系統中厭氧菌、好氧菌的纖維素酶活性、酶穩定性以及纖維素降解率.

由表8可見,實驗2的培養條件比較理想,因為厭氧菌和好氧菌產酶比較均衡,且酶穩定性較高,對纖維素的降解效果明顯.實驗2和實驗3的培養條件僅在氮源組成上有差別,而實驗2得到的厭氧菌和好氧菌酶活性都高于實驗 3,分別提高到1.12倍和1.72倍,纖維素降解率分別提高了2.5%和 11.7%,說明無機氮更容易被微生物吸收利用,廢水生化處理系統中適當濃度的氨氮對厭氧微生物的生長有刺激作用[18].實驗1的酶穩定性較低,可能是Co2+的濃度偏高,不利于底物與酶活性中心的結合,導致酶活性隨時間變化呈下降趨勢.

表7 正交實驗優化得到的培養條件Table 7 Culture conditions optimized by orthogonal experiments

表8 三種培養條件下的實驗結果Table 8 Results under three kinds of culture conditions

本研究得到的纖維素降解率不到 40%,理論上還有一定的提升空間.纖維素的降解需要多種酶的協同作用,今后可以考慮在廢水生化處理系統中加入人工篩選的優勢菌,構建產多種纖維素酶的高效穩定復合菌系[19],提高纖維素的處理率.

3 結論

3.1 厭氧菌產酶及降解效果最佳的實驗條件組合一致,均為30mg/L MgSO4、30mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、CO(NH2)2:NH4Cl=1:2的混合氮源、pH6.0.

3.2 好氧菌產酶效果最佳的實驗條件組合為30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、氮源為NH4Cl,pH7.0,而降解效果最佳的組合為30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、CO(NH2)2: NH4Cl=1:2的混合氮源、pH7.0.

3.3 在厭氧-好氧廢水處理系統中,當培養條件為 30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、氮源為NH4Cl (28.7mg/L)、pH7時,微生物的產酶和降解效果最佳,厭氧菌及好氧菌酶活性分別為4801 U/L、4794U/L,酶穩定性分別達到 91.0%、95.5%,纖維素降解率為 31.9%和28.4%.

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Optimization of synthetic culture condition of cellulase producing strains using orthogonal experimental design.

HUANG Rong-zi1,2, WAN Jin-quan1*, MA Yong-wen1, HUANG Ming-zhi1,3, YANG Yi-qing1(1.College of Environmental Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；2.Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministry of Education, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641,China). China Environmental Science, 2012,32(1)：130～135

The five single factors for cellulose biodegradation ability of cellulase producing strains were optimized by orthogonal experiments using mixed carbon source under 30°C, and were used in wastewater treatment system with anaerobic and aerobic processes. Five single culture factors promoted cellulase activity and cellulose degradation-rate in varying degrees. Moreover, the optimal culture conditions of anaerobe obtained through orthogonal experiments were not in accordance with that of aerobe. In the wastewater treatment system, the optimal synthetic condition was MgSO4of 30mg/L, CoCl2of 20mg/L , the ratio of CNP of 400:5:1, NH4Cl (of 28.7mg/L) as nitrogen source and pH7.0 . The cellulase activities (CA), enzymatic stabilities (ES), and cellulose degradation-rates (CDR) of anaerobe and aerobe were as follows: CA: 4801U/L, 4794U/L; ES: 91.0%, 95.5%; CDR: 31.9%, 28.4% .

orthogonal experiment；enzyme activity；enzymatic stability；cellulose degradation rate

2011-04-25

廣東省首批“節能減排”重大專項“造紙廢水循環利用新技術集成與示范”(2008A080800003);廣東省自然科學基金(S2011040000389);中央高校基本科研業務費專項資金資助(2011ZM0049)

* 責任作者, 教授, ppjqwan@scut.edu.cn

X172

A

1000-6923(2012)01-0130-06

黃蓉姿(1986-),女,廣東汕頭人,華南理工大學碩士研究生,主要從事工業廢水生物處理的研究.發表論文1篇.