一株耐酸產氫突變株Pantoea agglomerans的篩選與產氫特性

劉洪艷,朱大玲,王文磊 (天津科技大學海洋科學與工程學院,天津市海洋資源與化學重點實驗室,天津 300457)

一株耐酸產氫突變株Pantoea agglomerans的篩選與產氫特性

劉洪艷*,朱大玲,王文磊 (天津科技大學海洋科學與工程學院,天津市海洋資源與化學重點實驗室,天津 300457)

以紅樹林污泥中分離的厭氧發酵產氫細菌Pantoea agglomerans BH18為出發菌株,利用轉座子Tn7隨機插入菌株基因組DNA,通過卡那霉素篩選與 PCR擴增驗證,獲得一批轉座子插入突變菌株.起始 pH4.0培養條件下,以產氫量為指標分離獲得一株耐酸產氫突變菌株TB220.多次傳代結果表明,突變菌株TB220具有穩定的產氫遺傳特性.起始pH3.5～7.0范圍內,突變菌株TB220最適產氫pH值為6.0,產氫量為(2.39±0.08)mol H2/mol葡萄糖.起始pH4.0和葡萄糖濃度10g/L的海水培養條件下,突變菌株TB220產氫量為(0.47 ± 0.02)mol H2/mol葡萄糖,比野生菌株高70%,表現出較強耐酸性.

成團泛菌；產氫量；轉座子耐酸

生物制氫是目前化石能源燃料的替代途徑之一,主要包括藻類、光合細菌和厭氧發酵細菌制氫3種方式,其中厭氧發酵細菌產氫效率要高于藻類和光合細菌[1-2].近年來,研究人員將有機廢水或廢渣等處理與厭氧發酵細菌制氫技術結合起來,使得厭氧發酵細菌制氫技術具有更廣闊的應用前景[3].目前,已報道高效厭氧發酵產氫細菌,例如: Enterobacter cloacae IIT-BT 08、Enterobacter aerogenes 、 Clostridium acetobutylicum ATCC 824、 Ethanoligenens harbinense YUAN-3、Pantoea agglomerans等[4-8].這些菌株產氫量一般在 2mol H2/mol 葡萄糖左右,而厭氧發酵細菌產氫量理論值為 4mol H2/mol葡萄糖.厭氧發酵細菌在產氫過程中會同時產生有機酸,有機酸的累積將導致發酵液 pH值降低,發酵細菌的生理代謝活動逐漸受到抑制,甚至停止,即產生有機酸反饋抑制[9-10],因而造成菌株實際產氫量與理論產氫量相差比較大,酸累積也成為了細菌發酵制氫工業化生產的制約因素.從目前研究來看,解決發酵細菌的有機酸反饋抑制主要有2種途徑:一是采用厭氧發酵細菌與光合細菌(或酵母菌)耦聯發酵產氫,通過后者對小分子有機酸的利用與消除,重新提高發酵液pH 值[9-14].然而,無論是光合細菌還是酵母菌,其自身產氫速率很低,耦聯發酵產氫的整個過程在經濟可行性上仍是個問題[15].二是在實際生產中采用化學中和法維持產氫體系中的 pH值,但該法既不經濟,又容易導致反應器生態系統受到破壞[16].因此,引入高酸條件下仍具有較強代謝活力的耐酸型產氫細菌,將有利于提高產氫效率.

在野生型菌株基礎上,通過誘變手段獲得產氫突變菌株的相關研究已經開展[16-21].這些誘變手段主要集中于物理或化學手段,然而關于分子生物學手段誘變,比如轉座子插入突變技術,應用于厭氧發酵細菌的報道還比較少.本研究利用分離自海洋環境的產氫細菌 Pantoea agglomerans為出發菌株,采用Tn7轉座子構建菌株的轉座子突變文庫,在此基礎上篩選產氫突變菌株并進行耐酸性能研究,為進一步構建耐酸性產氫工程菌株奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 菌種

厭氧發酵產氫細菌Pantoea agglomerans野生菌株分離自紅樹林污泥,由本實驗室保存.

1.2 培養基

野生菌株培養采用LM培養基(g/L):葡萄糖20、胰蛋白胨 4,牛肉膏 2,酵母粉 1,NaCl 30, K2HPO41,MgCl20.1,FeSO4·7H2O 0.1,L-半胱氨酸 0.5.微量元素液(g/L,MnSO4·7H2O 0.01, ZnSO4·7H2O 0.05,H3BO30.01,CaCl2·2H2O 0.01, Na2MoO40.01,CoCl2·6H2O 0.2) 10mL,維生素溶液(g/L,L-抗壞血酸VC0.025,檸檬酸0.02,吡哆醛0.05,對氨基苯甲酸 0.01,生物素 0.01,維生素 B10.02,核黃素0.0250) 10mL.菌株活化采用LB培養基(g/L):胰蛋白胨 10,酵母提取物 5,NaCl 10.菌株感受態細胞制備采用2×YT培養基(g/L):胰蛋白胨 16,酵母提取物10,NaCl 4.復蘇電轉化產物采用SOC培養基(g/L):胰蛋白胨 2 0,酵母提取物5.0,NaCl 0.5,KCl 1.86,MgCl22.03,葡萄糖3.6.

1.3 轉座子突變菌株Pantoea agglomerans

1.3.1 感受態細胞的制備 (1)活化 Pantoea agglomerans菌株接種于 50mL 2×YT培養基中,18℃ 120r/min培養使細菌分光光度值達到0.4～0.6. (2) 4℃,2500g離心15min,棄上清收集菌體,用預冷的 50mL雙蒸水輕輕懸浮菌體.(3) 重復步驟(2)3次,預冷雙蒸水的體積分別為 25,10, 5mL,最后于4℃,2500g離心15min收集菌體. (4)向沉淀中加140μL預冷雙蒸水和DMSO 2μL,懸浮的感受態細胞等量分裝(40μL)于無菌離心管中,立刻或-80℃保存用于電轉化.

1.3.2 轉座過程 首先,反應體系中加入1μL轉座子質粒 pGPS3、1μL DNA和 1μL轉座酶TnsABC,加水至總體積20μL,37 ℃溫育1h.然后,利用DNA聚合酶Ⅰ填補轉座插入反應產生的缺口,利用酚/氯仿抽提后,加 1μL DNA聚合酶Ⅰ, 3μL 10×Buffer, 9μL dNTP,室溫放置 15min,加1μLT4連接酶(400U,ATP終濃度為 1mmol/L), 16℃溫育 4h.最后,利用稀有反應酶 PISceⅠ ( VDE)酶切轉座產物,使轉座子重組 DNA能夠有效轉化到大腸桿菌細胞中.酚/氯仿抽提后,加入6μL PI-SceⅠ (6U),5μL 10×PI- SceⅠ緩沖液, 0.5μL牛血清蛋白,18.5μL水,37℃溫育1～2h后, -20℃中保存留用.

1.3.3 電轉化步驟 把0.2～0.5μg轉座產物加入到 40μL感受態細胞中,混合后于冰上放置.設置電轉化儀(BIO-RAD)參數為電壓 1.8kV.將冰上放置的混合物加入到 0.2cm預冷電轉杯中開始電擊.電擊產物快速從電轉化杯中轉移到裝有1mL SOC培養基的離心管內,37℃, 150r/min復蘇1h.復蘇產物于2000g離心1min,棄上清,剩余100μL用于懸浮細胞,涂布于含濃度卡那霉素的LB培養基中,37℃過夜培養.

1.4 耐酸產氫突變菌株的篩選

1.4.1 轉座子突變菌株的鑒定 在 LB培養平板(卡那霉素濃度 40μg/mL)上生長的菌落,即表示可能發生了轉座.隨機挑取單菌落340個, 37℃過夜培養, 2500g離心后,提取細菌基因組DNA,作為PCR反應的模板.引物序列按轉座子突變試劑盒提供,引物P1: 5'-TTAAGGATTATTTAGG-GAAG-3';P2: 5'-ACAATAAAGTCTTAAACTAG-3'.PCR反應體系(50μL):buffer 5 μL(10×),引物P1和P2各1μL(10μmol/L),dNTP 1μL(10 mmol/ L),Taq DNA聚合酶1 μL(5U/L),模板lμL,超純水40μL.反應程序為 94℃ 4min;94℃ 30s,49℃30s;72℃ 1min,30個循環;72℃, 10min.

1.4.2 突變菌株耐酸性能測定 突變菌株接種于不同pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的發酵培養基,測定各突變菌株生長及產氫指標(細菌生物量、發酵液的pH值、氧化還原電位ORP、葡萄糖利用率和產氫量等,篩選耐酸產氫突變菌株.

1.5 分析方法

pH值和氧化還原電位測定采用 DLELTA–320型酸度計量.A600采用島津分光光度計.氣體收集采用排水法.利用氣相色譜儀(型號 6820, Agilent)測定發酵氣體中氫氣的含量.氮氣做載氣,流量為 30mL/min,色譜柱填料為 5A分子篩(60/80目),柱長 2m,檢測器為熱導檢測器(TCD),柱溫、進樣器和檢測器分別為40,200,200℃.

2 結果與討論

2.1 轉座子插入突變菌株的鑒定

野生菌株Pantoea agglomerans接種于不同起始pH值的培養液中,結果表明,菌株能夠在起始pH5.0的條件下產氫,產氫量為(0.6 ± 0.02) mol H2/mol葡萄糖.Chen等[22]報道 Clostridium butyricum CGS5在起始pH值為5.0時,不能產氫.支曉鵬等[23]研究發現 Enterobacter sp.C32在起始 pH值 5.0的產氫微弱,只有 3.3mL/L.菌株Pantoea agglomerans能夠在起始5.0的條件下進行產氫,表明該菌株具有一定的耐酸性,作為本實驗轉座子Tn7插入突變的出發菌株.

利用轉座子對成團泛菌進行隨機突變,構建轉座突變體文庫,用以篩選耐酸型產氫突變株.在含卡那霉素濃度40μg/mL分離瓊脂平板上長出的單菌落即為插入轉座子的突變體,陰性對照無菌落生長.提取突變菌株基因組DNA,經PCR擴增驗證,突變菌株的PCR擴增產物在1699bp處具有特異性片段(圖1),該片段大小與轉座質粒陽性對照的擴增片段大小一致,證實突變菌株含有Tn7轉座子插入片段.以野生菌株 DNA為模板,PCR產物無擴增片段.在隨機挑選340個菌落中,通過 PCR檢測發現有 331個突變菌株含有Tn7轉座子插入片段.

圖1 Tn7的PCR檢測Fig.1 PCR amplification of Tn7 from the genome of mutants

2.2 耐酸產氫突變菌株的篩選

轉座子插入突變菌株接種于 LM液體培養基中,在起始 pH4.0條件下進行厭氧發酵產氫和耐酸馴化篩選.以Pantoea agglomerans野生菌株產氫量為對照,隨機挑取的331株突變株中,篩選出9個突變株的產氫量有明顯提高,其他突變菌株的產氫量與野生菌株相當或降低.在起始pH4.0培養條件下,以單位葡萄糖產氫氣的摩爾數為標準進行比較,突變菌株TB220的產氫量最高,為(0.47 ± 0.02 )mol H2/mol 葡萄糖,比野生菌株提高70%.

2.3 突變菌株TB220產氫特性

2.3.1 穩定性 突變菌株TB220接種到厭氧平板培養基上作為第1代,以后每隔36h傳代1次,分別于血清瓶中厭氧培養,測定其產氣量和氫氣含量,如此連續傳代,共傳代5次.取子代菌株提取DNA,進行PCR檢測,在5代菌株中都能擴增出轉座子特異性序列(1699bp).以上結果表明,轉座子Tn7的插入具有穩定遺傳性,這與Paul等[24]驗證Tn5轉座子在Burkeholderia glumae中穩定性的實驗結果相一致.突變菌株TB220的產氫穩定性是通過5代菌株之間產氫量的差異來確定.由圖2可以看出,突變菌株TB220連續傳代5次,產氫量和氫氣含量分別維持在(0.46±0.02)mol H2/mol葡萄糖和(25.93±2.39)%.

圖2 突變菌株TB220的產氫穩定性Fig.2 Hydrogen production stability of mutantTB220

2.3.2 產氫過程 圖3可以看出,起始pH4.0時,突變菌株TB220在發酵12h進人對數生長期,生物量最大值為 1.284,較原始菌株明顯提高(原始菌株為0.646).突變菌株TB220發酵液pH值在發酵12h后開始明顯下降,在發酵時間24h時發酵液 pH值基本不再變化,表明產氫主要發生在發酵時間 12～24h,產氫過程中發酵液 pH值在3.79～3.44之間.氧化還原電位(ORP)能夠作為產氫過程的一個實時監測指標,高產氫率對應于發酵液的低ORP值[8].在產氫過程中發酵液ORP始終處于一個比較低的值(-33mV左右).

圖3 起始pH 4.0培養條件下突變菌株TB220pH值, ORP和OD600變化Fig.3 Variation of pH,ORP and OD600 of mutantTB220 at the initial pH value of 4.0

2.3.3 耐酸性 由圖4可見,在起始pH3.5～10.0的范圍內突變菌株都能生長,最適生長 pH7.0.突變菌株TB220在pH3.5時不能產氫,在pH4.0～7.0測定其產氫特性.由圖 4可以看出,突變菌株TB220在起始 pH4.0～7.0的范圍內都能夠產氫,最適產氫pH6.0,產氫量為(2.39±0.08)mol H2/mol葡萄糖.Yokoi等[16]分離到的耐酸產氣腸桿菌HO-39最適發酵產氫pH值為6～7,在pH4.0下也能夠生長與產氫,這與突變菌株TB220相當.

圖4 起始pH值對突變菌株TB220產氫量的影響Fig.4 Effect of initial pH on hydrogen production of mutantTB220

起始pH4.0的培養條件下,成團泛菌野生菌株產氫能力明顯下降,產氫量僅為(0.21±0.04) mol H2/mol葡萄糖,而突變菌株產氫量比野生菌株提高70%,顯示出較明顯耐酸產氫特性.與物理或化學誘變相比,轉座子插入突變可以利用轉座子的已知序列作為標簽,在獲得耐酸產氫突變菌株TB220的基礎上,通過測定突變基因序列研究突變相關基因,為在分子水平上解釋相關耐酸機理提供前提.

3 結論

3.1 利用Tn7轉座子隨機插入成團泛菌基因組DNA,獲得一批產氫突變菌株,其中突變菌株TB220在起始pH4.0條件下具有較高產氫能力.

3.2 突變菌株TB220連續傳代5次,通過卡那霉素選擇性篩選和PCR驗證,表明該突變菌株具有穩定的產氫遺傳特性.

3.3 與野生菌株相比,突變菌株 TB220的耐酸性和產氫能力明顯提高.在起始pH值4.0的海水培養條件下,突變菌株 TB220產氫量為(0.47 ± 0.02)mol H2/mol 葡萄糖,比野生菌株提高 70%,表現出較強耐酸性.

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Screening of an aciduric hydrogen producing mutant Pantoea agglomerans and characterization of hydrogenproduction.

LIU Hong-yan*, ZHU Da-ling, WANG Wen-lei (Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry, College of Marine Science and Engineering,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) . China Environmental Science, 2012,32(1)：125～129

A Tn7-based transposon was randomly inserted into genomic DNA of Pantoea agglomerans BH18, isolated from mangrove sludge. Mutants were screened by Kanrand amplification of the inserted sequences. At the initial pH 4.0, an aciduric and highly effective hydrogen producing mutant TB220 was screened using hydrogen production as screening index. The aciduric mutant TB220 was tested to have steady heredity and hydrogen-producing capability in several passages. The mutant TB220 was able to produce hydrogen over a wide rang of initial pH from 3.5 to 7.0, with an optimum initial pH of 6.0, and hydrogen production was (2.39 ± 0.08)mol H2/mol glucose. Under the marine conditions with the initial pH of 4.0 and glucose concentration of 10 g/L, hydrogen production of the mutant TB220 was (0.47 ± 0.02) mol H2/mol glucose, increasing by 70% compared with wild type. This indicated that the mutant showed high acid resistance capability.

Pantoea agglomerans；hydrogen production；transposon aciduric

2011-04-04

國家自然科學基金資助項目(40906074);天津市海洋資源與化學重點實驗室開放基金(200912)

* 責任作者, 講師, hongyanliu1214@163.com

X172

A

1000-6923(2012)01-0125-05

劉洪艷(1977-),女,吉林通化人,講師,博士,主要從事海洋微生物研究.發表論文10余篇.