抗艾滋病藥物F18和尼非韋羅在Solutol HS15形成復合制劑后的高效液相色譜測定

劉超，袁鐘平，吳稚偉

(南京大學醫學院公共健康醫學研究中心，江蘇南京 210093)

F18［1］是calanolide A(吡喃型香豆素類化合物)的含氯衍生物，作為一種新型的艾滋病毒非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)，正處于相關臨床研究中;尼非韋羅［2］為合成的小分子 CCR5(人CC趨化因子受體5)拮抗劑，具有良好的抑制HIV-1感染的效果，其已經作為殺微生物劑［3］在中國完成了臨床前研究，申請進行人體臨床試驗，二者的結構式見圖1。通過兩個或者兩個以上藥物混合起來的殺微生物劑被認為將有效提高阻斷HIV-1性傳播的效率，從而降低傳播率［4］。尼非韋羅是有效的CCR5侵入抑制劑，而F18能高效抑制病毒的逆轉錄，二者有望在抗感染上形成良好的互補，配伍為復合殺微生物劑，但是二者都具有水溶性差的特點(溶解度都小于100 μg·ml-1)。本研究觀察增溶劑Solutol HS15［7］同時溶解F18和尼非韋羅的效率，同時探索液相色譜條件［5-6］使之能夠有效地區分這兩種化合物，為后續的研究奠定基礎。

圖1 F18和尼非韋羅的化學結構式Fig 1 Molecular structure of F18 and nifeviroc

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀;島津LCsolution色譜工作站GL Science Inertsil ODS column(4.60 mm ×250 mm，5 μm);BT124S 電子天平(德國賽多利斯);pHSJ-4A型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)。尼非韋羅對照品(上海靶點藥物有限公司，批次200910，純度＞98%)，F18(中國醫學科學院藥物研究所提供，20091009，純度 ＞98%)，Solutol HS15(巴斯夫中國有限公司提供)，甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(4.60 mm×250 mm，5 μm)，采用甲醇(A 相)-復方醋酸緩沖液(B相，pH 4.5)為洗脫系統流動相。復方醋酸緩沖液配制方法:稱取醋酸銨2.3 g，加水500 ml溶解并用醋酸調節pH至4.5，然后稱取樟腦磺酸2.3 g，加水至1 000 ml。A 相和 B 相比例為65 ∶35，流速為1 ml·min-1，檢測波長為265 nm，柱溫為30℃，進樣量為20 μl。相鄰兩峰的分離度不小于1.5。

1.3 對照品溶液的制備

精密稱取F18 10 mg、尼非韋羅10 mg，將混合物加入10 ml容量瓶中，用甲醇定容制成1 mg·ml-1的溶液，作對照品線性貯備液。稀釋對照品貯備液，得20、60、100、140、180 μg·ml-1系列濃度對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

精密稱取F18 10 mg、尼非韋羅10 mg，同時置于2 ml Solutol HS15中至完全溶解，將混合物加入10 ml容量瓶中，用甲醇定容制成1 mg·ml-1的溶液，作供試品線性貯備液。稀釋供試品貯備液，得20、60、100、140、180 μg·ml-1系列濃度供試品溶液。

1.5 陰性對照液的制備

取2 ml Solutol HS15，用甲醇定容至10 ml容量瓶中。

1.6 檢測波長的選定

采用紫外分光光度計測定兩種藥物的吸光度，從250～280 nm進行測定，1 nm為間隔，出現了一個拋物線狀的吸收峰，取二者峰值最大處265 nm為HPLC檢測條件。

2 結 果

2.1 專屬性試驗

分別精密吸取進樣溶液各20 μl注入液相色譜儀，在選定的色譜條件下進樣測定，結果見圖2。由圖2可見，F18和尼非韋羅在Solutol HS 15(HS15)中的測定無干擾，且能完全區分兩種物質。

圖2 化合物的高效液相色譜結果Fig 2 HPLC results of F18 and nifeviroc in Solutol HS15

2.2 線性范圍

稀釋對照品貯備液，得 20、60、100、140、180 μg·ml-1系列濃度對照品溶液，在選定的色譜條件下分別進樣20 μl，記錄各色譜峰面積，以峰面積為縱坐標、進樣量為橫坐標進行線性回歸，各化合物的回歸方程及相關系數見表1，兩種化合物的線性范圍均為20～180 μg·ml-1。

表1 回歸方程和相關系數Tab 1 Regression equation and correlation coefficient

2.3 樣品檢出限試驗

取上述1 mg·ml-1的樣品溶液，分別稀釋 10、100、1 000 倍，樣品稀釋至 100、10、1 μg·ml-1，仍然非常穩定，說明樣品的含量極少時仍然能夠被靈敏地檢測出。

2.4 精密度和穩定性

取1 mg·ml-1供試品，連續進樣6次，其 RSD為0.943 808%(RSD＜5%)，表明本方法精密度良好。取上述供試品溶液，進行穩定性考察，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h 進樣20 μl測定，其 RSD 為1.091 056%，結果表明供試品溶液室溫放置24 h穩定。取同一混合對照品溶液3組，分別在24、48、72 h按前述色譜條件進樣測定，計算方法的精密度，結果為RSDF18=0.99%，RSD尼非韋羅=1.07%，表明本法的精密度良好。

2.5 加樣回收率試驗

精密稱取F18和尼非韋羅各8、10、12 mg，每組3份，加入 10 ml容量瓶中，制備濃度為 0.8、1.0、1.2 mg·ml-1的溶液各3份，按上述色譜條件測定低、中、高3個加樣水平平均回收率，結果顯示F18 3個加樣水平的平均回收率分別為102.5%(RSD=1.32%)、101.6%(RSD=1.43%)和 98.8%(RSD=1.51%)，加樣平均回收率為100.5%(RSD=2.32%，n=9);尼非韋羅3個加樣水平分別為101.4%(RSD=1.17%)、100.2%(RSD=1.35%)和 99.8%(RSD=1.51%)，加樣平均回收率為100.4%(RSD=1.52%，n=9)。

3 討 論

Solutol HS 15是一種現代高效能、極低毒性的增溶劑，溶血作用低;生理耐受性較高;可用蒸汽滅菌法，無需昂貴的無菌制造工藝;由于其溶解兩種藥物都能達到10 mg·ml-1以上的溶解度，而且溶解后和中性磷酸緩沖液混合后呈澄清狀態，無明顯的藥物析出跡象，符合陰道內環境使用，因此適合應用在殺微生物劑研究領域。本研究將其作為F18和尼非韋羅的溶劑的結果顯示，Solutol HS 15能夠很好地溶解F18和尼非韋羅。本研究選用的是緩沖鹽洗脫體系，選用的增溶劑和流動相的高效液相檢測結果精密度、穩定性、線性關系良好，藥物在溶劑中能夠長時間地儲存而且沒有明顯的分解，液相條件二者的峰值區分度良好。本研究所建立的分析檢測條件具有較好的線性動態范圍，良好的重復性和靈敏度，能夠為后續的研究提供有效的檢測和分析手段，為以后的陰道殺微生物劑及聯合用藥奠定了基礎。本研究僅僅局限于色譜條件的摸索，缺乏相應的病毒學數據，在以后的研究中將會利用本研究成果進一步進行細胞學和動物學的相關實驗。

［1］LU X，LIU L，ZHANG X，et al.F18，a novel small-molecule nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor，inhibits HIV-1 replication using distinct binding motifs as demonstrated by resistance selection and docking analysis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(1):341-351.

［2］XIE W D，CHENG Z.Determination of nifeviroc，a novel CCR5 antagonist:application to a pharmacokinetic study［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，56(3):637-640.

［3］PADIAN N S，McCOY S I，ABDOOL-KARZW S S，et al.HIV prevention transformed:the new prevention research agenda［J］.Lancet，2011，378(9787):269-278.

［4］LIU S，LU H，NEURATH A R，et al.Combination of candidate microbicides cellulose acetate 1，2-benzenedicarboxylate and UC781 has synergistic and complementary effects against human immunodeficiency virus type 1 infection［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49(5):1830-1836.

［5］倪沖，繆玉山，陳國明.高效液相色譜法測定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有關物質的含量［J］.東南大學學報:醫學版，2008，27(5):365-367.

［6］吳佳聰，彭丹紅，任慕蘭.陰道微生態的研究進展［J］.東南大學學報:醫學版，2010，29(6):702-706.