利用剩余污泥水解酸化液合成聚羥基脂肪酸酯的研究

盛欣英 ,熊惠磊 ,孫 潤 ,陳國強 ,施漢昌 ,張慶竹 ,王 慧 * (.山東大學環境研究院,山東 濟南5000；.清華大學環境學院,北京 00084；.清華大學生命科學學院,北京 00084)

利用剩余污泥水解酸化液合成聚羥基脂肪酸酯的研究

盛欣英1,2,熊惠磊2,孫 潤2,陳國強3,施漢昌2,張慶竹1,王 慧2*(1.山東大學環境研究院,山東 濟南250100；2.清華大學環境學院,北京 100084；3.清華大學生命科學學院,北京 100084)

以城市污水處理廠剩余污泥水解酸化產物為原料,研究了羅氏真養菌(Ralstonia eutropha)H16在水解酸化液中的生長規律和聚羥基脂肪酸酯(PHAs)積累特性,同時分析了H16對水解酸化液中各種有機酸組分的利用規律. 結果表明,以剩余污泥52℃中溫水解酸化48h的水解酸化液為培養基,在HAc水解酸化液(C/N/P=100/10/1, TOC＝2881mg/L,乙酸占總有機酸含量36.1%)中,H16最先利用乙酸和正丁酸來進行自身的生長和PHAs的合成,合成的主要產物是聚羥基丁酸酯(PHB);隨后開始利用丙酸和正戊酸,在此過程中聚羥基戊酸酯(PHV)的含量也逐步上升,菌體量同步增長, H16在40h左右處于平穩期,并且達到最大積累率為12.51%(占菌體干重);最后利用的是異丁酸和異戊酸,但是此時H16已經進入衰亡期,菌體量和PHAs合成率都在下降.當以HVa水解酸化液(C/N/P=100/10/1, TOC＝2358mg/L,異戊酸占總有機酸含量29.0%)為培養基時, H16在18h達到生長的峰值,24h達到PHAs合成率的最大值為32.14%(占菌體干重),PHV為PHAs的主要形式.

聚羥基脂肪酸酯(PHAs)；羅氏真養菌H16；剩余污泥；水解酸化液；揮發性有機酸(VFAs)

聚羥基脂肪酸酯(PHAs)是一種生物聚酯,是由微生物在不平衡的生長條件下,如氮、磷、硫等營養物質缺乏而碳源相對過剩,在微生物體內合成的胞內碳源和能源儲藏性物質.PHAs不但擁有與聚乙烯、聚丙烯等石油化工產品相似的熱塑性與力學性能, 而且能夠被許多微生物利用自身分泌的PHAs解聚酶降解.因此,作為最新一代生物可降解塑料,PHAs可以取代污染日益嚴重的石油化工塑料,同時在農業、醫藥、精細化工等方面也有著極高的應用價值,具有良好的應用前景和巨大的經濟效益[1-4].

微生物合成PHAs可利用的碳源有很多,如碳水化合物(葡萄糖、蔗糖等)、醇類(甲醇、乙醇等)、有機酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乳酸等)[5-6].其中,短鏈有機酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等)可以通過厭氧條件下將剩余污泥、食品、農業廢物等進行水解酸化來獲得,這不但使廢物資源得到利用,實現剩余污泥的減量化、資源化,并且可以有效地降低PHAs的生產成本[7-8],因此利用污泥生產PHAs成為研究熱點.

羅氏真養菌(Ralstonia eutropha)能夠利用各種碳源合成PHAs,關于該菌株在營養限制條件下(如限氮或限磷等)利用葡萄糖、實驗室配制的單一或者混合有機酸為碳源積累PHAs的研究有很多[9-10],但該菌株以水解酸化液為碳源合成 PHAs的研究尚未有報道.本課題組在研究剩余污泥資源化過程中獲得了分別以乙酸和戊酸為主要有機酸組分的 2種水解酸化液,本文研究了羅氏真養菌 H16利用剩余污泥厭氧水解酸化產物合成PHAs的過程,以及對水解酸化液中各種揮發性有機酸(VFAs)和其他溶解性有機物的利用規律,探索PHAs的積累特性與水解液中各種有機酸消耗的關系,旨在為開發城市污水廠剩余污泥減量及資源化技術提供理論指導和技術支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 羅氏真養菌(Ralstonia eutropha H16,以下簡稱H16),由清華大學生命科學學院微生物實驗室提供.

1.1.2 培養基 礦物培養基(g/L):葡萄糖20,氯化銨0.5,硫酸鎂0.2,十二水合磷酸氫二鈉9.65,磷酸二氫鉀1.5,微量元素溶液I 10mL/L,微量元素溶液II 1mL/L.

微量元素溶液I(g/L): 檸檬酸鐵銨5,二水合氯化鈣2.

微量元素溶液 II(g/L):七水合硫酸鋅 0.1,四水合氯化錳0.03,硼酸0.3,六水合氯化鈷0.2,五水硫酸銅 0.01,六水合氯化鎳 0.02,二水合鉬酸鈉0.03.

LB培養基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,氯化鈉5. 1.1.3 水解酸化液制備 將剩余污泥的厭氧消化水解控制在產酸階段,可以獲得富含揮發性脂肪酸的發酵液,以下簡稱水解酸化液.在水解罐中,加入取自北京市小紅門污水處理廠二沉池的污泥,在 52℃下中溫水解酸化 48h后排泥,4℃10000r/min,離心 30min后取得上清液.通過控制水解酸化的條件(此部分成果待發表),獲得了分別以乙酸(HAc)和戊酸(HVa)為主要 VFAs組分的水解酸化液,2種水解酸化液中有機酸的組分如表1所示.

表1 不同條件獲得的水解酸化液的成分Table 1 Compositions of AFL obtained in different fermentation conditions

1.2 培養方法

1.2.1 菌種活化 -80℃凍存的 H16菌種于20mL LB培養基中培養48h,然后按10%接種量于100mL LB培養基中培養24h,之后按照10%接種量于礦物培養基中培養 48h后作為實驗用種子液.搖床條件均為150r/min、30℃.

1.2.2 搖瓶培養 控制接種量使得初始培養基中菌體生物量為0.3g/L,接種于2種水解酸化液中培養60h,每種水解酸化液設置3個平行樣.在培養過程中定時取樣測定VFAs、TOC、菌體生物量(DCW)、PHAs等指標.

1.3 檢測與分析方法

1.3.1 細胞干重(DCW)測定 菌體于 4℃10000r/min,離心 10min,生理鹽水洗滌 2次,于-50℃下真空冷凍干燥24h[11].

1.3.2 VFAs測定 培養過程中取得的菌液4℃10000r/min,離心 2min,去除大部分菌體后,經過0.22mm膜過濾,調pH＜2,進行氣相色譜(HP-6890)分析[12].

1.3.3 PHAs含量測定 稱取一定量冷凍干燥菌體于酯化罐中,加入2mL氯仿、1mL酯化液(甲醇90%、濃硫酸10%、10g/L苯甲酸內標)于100℃反應4h,冷卻后加入1mL水,震蕩、靜置、分層,取下層有機相進行氣相色譜(島津 GC-2014)分析[13].

2 結果與討論

2.1 菌體生長、有機質利用與PHAs合成

圖1 HAc水解酸化液中TOC降解與菌體生長規律Fig.1 Evolution of TOC and cell growth of H16 in AFL containing a major VFA of acetic acid

由圖1～圖3可見,0～20h,菌體的生長非常迅速,DCW迅速增加,PHAs也迅速合成,同時TOC迅速降低,但培養基中的 VFAs/SCOD沒有顯著變化,說明培養基中的VFAs和其他非VFAs碳源被同時利用. 20～40h,菌體表現為生長和 PHAs積累同步進行,菌體的增加量沒有0～20h顯著,但PHAs的產率與0～20h基本相同;這時TOC仍保持隨時間降低的趨勢,但VFAs/SCOD降低更快,說明H16在20～40h內VFAs的利用高于非VFAs的利用. Fernando等[19]在研究高壓堿熱解處理剩余污泥獲得堿熱解液中也發現,活性污泥微生物利用其中非 VFAs部分的碳源進行自身生長,利用VFAs部分的碳源進行PHA積累.在本研究中也觀察到了當非 VFAs碳源大量消耗時,菌體量有顯著增加的現象.40～60h,雖然其菌體量基本不變,水解酸化液中的TOC不再下降, VFAs/SCOD的比例也基本不變,而菌體 PHAs合成率卻在急劇下降,這說明H16已經將水解酸化液中可利用的碳源基本利用完畢,而開始利用自身儲藏的碳源PHAs進行維持正常的生命活動.

圖2 HAc水解酸化液中VFAs/SCOD變化與菌體生長規律Fig.2 Evolution of VFAs/SCOD and cell growth of H16 in AFL containing a major VFA of acetic acid

圖3 HAc水解酸化液中PHAs積累與菌體生長規律Fig.3 PHAs accumulation in H16 during cell growth in AFL containing a major VFA of acetic acid

2.2 H16對HAc水解酸化液中VFAs的利用與PHAs的積累

不同的水解酸化條件產生的水解酸化液的組成和含量會有很大不同[14].而菌株對不同VFAs的利用效率以及合成PHAs的種類也是不同的[15-18].因此,本文研究了H16對HAc水解酸化液中不同 VFAs利用隨時間的變化情況,同時探究了VFAs的變化與合成的PHAs的種類之間的關系.

圖4 HAc水解酸化液中各組分隨時間變化Fig.4 Evolution of the concentrations of different VFAs in AFL containing a major VFA of acetic acid

由圖4可見,0～20h,6種VFAs都在消耗,但乙酸和正丁酸利用的更快,消耗也更多;20～40h,丙酸和正戊酸的消耗逐漸加快,異戊酸和異丁酸的消耗相對緩慢,至 50h左右基本利用完畢.這說明H16對HAc水解酸化液中6種酸的利用是有先后順序的,分別是:乙酸、正丁酸、丙酸、正戊酸、異丁酸、異戊酸,利用規律是先短鏈后長鏈、先直鏈后支鏈. H16以HAc水解酸化液為培養基合成PHAs的組成結構和單體的相對含量如表2所示.

表2 不同時間內的H16合成PHAs的組成結構和單體相對含量Table 2 PHAs content in H16 and monomer compositions of the PHAs in AFL containing a major VFA of acetic acid

由表 2可知,由于乙酸和正丁酸的快速消耗,0～20h時主要合成的是PHB,占PHAs含量的86.50%,同時合成一定量的 PHV.20～30h時,乙酸含量繼續降低,正丁酸基本用完,合成的 PHB的絕對含量也繼續升高;同時其他種類的有機酸如丙酸、正戊酸等的消耗也逐漸加快,這時PHV的合成率也開始逐步的提高, PHV占PHAs總含量的18.63%.30～40h,乙酸被利用完,PHB的合成量也達到了最大;丙酸也消耗了絕大部分,異丁酸和異戊酸的消耗增多,PHV的合成率也達到了最大值,40h菌體的 PHAs合成率達到了最大值為12.51%.由此可見,乙酸、丁酸主要是用來合成PHB,而丙酸、戊酸等主要是合成 PHV的原料. Akiyama等[20]研究了一株改良的羅氏真養菌分別以 C2～C22等不同鏈長有機酸為單一碳源合成PHA的規律,結果發現菌株利用偶數碳的有機酸主要合成 PHB,利用奇數碳的有機酸主要合成PHV.本研究中發現H16在HAc水解酸化液中也呈現了基本一致的規律.

在50h時,由于HAc水解酸化液中有機酸含量已經相當低了,不足以支持菌體的生長和PHAs的積累,所以H16的生物量開始下降,PHAs積累率下降得更快,說明菌體開始利用自身貯存的碳源和能源性物質 PHAs來維持正常的生命活動.由表 2可見,50h處菌體不再進行 PHAs的積累,PHB占總 PHAs含量的 78.89%,PHV占21.11%,PHB比PHV減少的快,這說明菌體在利用自身貯存的PHAs進行生長時,也優先利用PHB.

由表3可見,0～20h與20～40h內PHAs的產率基本一致,單位時間內合成的PHAs的質量基本相同,但是2個階段各種有機酸消耗的規律卻明顯不同.0～20h菌體生長更快,單位有機酸的PHAs產率也較高.相比之下,20～40h H16生長減慢,單位有機酸的PHAs產率也較低.對比這2個時間段內乙酸的消耗可以看出,20～40h消耗了更多的乙酸卻沒有產生更多的 PHAs,而是與0～20h的產率基本持平,這說明乙酸雖然消耗的快,但并不是都用于PHAs的積累,可能很大一部分用于微生物的生長.而長鏈的有機酸如丁酸、戊酸等可能更有利于PHAs的合成,且主要產物為 PHV. Ruan等[21]研究真養產堿桿菌利用乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等有機酸為單一碳源合成PHAs的過程中也發現長鏈有機酸比短鏈有機酸更有利于合成PHAs. Du等[22]利用乙酸作為共底物加入到壬酸或者辛酸中,可以提高PHAs的產量,并且發現乙酸本身主要用于細胞質的合成與能量供給.可見由于乙酸容易利用,水解酸化液中的乙酸可能會對PHAs的合成有一定的促進作用,但乙酸本身并不一定是合成PHAs的最佳碳源.

表3 HAc水解酸化液中PHA產率與有機酸消耗量的關系Table 3 Effect of VFAs on PHAs yield in AFL containing a major VFA of acetic acid

2.3 H16在HVa水解酸化液中PHAs的積累

圖5 HVa水解酸化液中TOC、DCW隨時間變化Fig.5 Change of TOC and cell growth of H16 in AFL containing a major VFA of iso-valeric acid

由表1可見,與HAc水解酸化液相比, HVa水解酸化液中各種有機酸的含量有很大差異, HVa水解酸化液中正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸含量占總有機酸的 74.4%.本課題組研究發現該菌株H16在不同水解酸化液中的VFAs利用情況基本同HAc水解酸化液一致.圖5和表4表明,H16在18h開始進入平穩期,TOC的消耗達到最低值,且基本保持不變,DCW 在此處達到最高值, 之后逐漸減少.在該水解酸化液中,H16于24h處PHAs合成率達到最大,為32.14%,顯著高于在HAc水解酸化液中積累率.本研究進一步證實了Ruan等[21]關于長鏈有機酸更有利于PHAs積累的發現. H16在HVa水解酸化液中主要合成的是 PHV,占 PHAs總含量的 80.93%,PHB占19.07%.這一結果表明H16在水解酸化液中利用戊酸主要合成PHV的結論.

表4 H16在HVa水解酸化液中PHAs合成情況Table 4 PHAs content and monomer compositions of H16 in AFL containing a major VFA of iso-valeric acid

由此可知,當水解酸化液中乙酸含量較高時,由于對乙酸的快速利用,微生物的生長較快,但PHAs的積累相對較慢,PHAs的合成以PHB為主.而當水解液中丁酸和戊酸的比例較高時,由于丁酸、戊酸等相對于乙酸較難利用,所以微生物的生長明顯減慢,但PHAs的合成則明顯加快,PHAs的合成以 PHV為主.有機酸組成的不同導致了H16在2種水解酸化液中的生長量和PHAs組成有較大的差異.

3 結論

3.1 羅氏真養菌H16能夠有效利用剩余污泥水解酸化液合成 PHAs,有機酸的組成會影響微生物的生長與PHAs的合成.在HAc水解酸化液中,其PHAs合成率最高為12.51%,合成的PHAs成分主要是PHB;在HVa水解酸化液中,其PHAs合成率最高為32.14%,合成的PHAs成分主要是PHV.

3.2 H16在HAc水解酸化液中有機酸的利用順序依次為乙酸、正丁酸、丙酸、正戊酸、異丁酸、異戊酸.當H16主要消耗乙酸、丁酸時,其合成的PHAs成分主要是PHB;當水解酸化液中的丙酸、戊酸開始快速消耗時,菌體內合成的PHV的百分含量也逐漸增加.

3.3 相對于HAc水解酸化液,H16在HVa水解酸化液中的菌體生長明顯減慢,PHAs的合成得到加強,HVa中的長鏈有機酸更有利于PHAs的合成.

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Polyhydroxyalkanoates production by Ralstonia eutropha H16 fed by waste sludge anaerobic fermentative liquid.

SHENG Xin-ying1,2, XIONG Hui-lei2, SUN Run2, CHEN Guo-qiang3, SHI Han-chang2, ZHANG Qing-zhu1, WANG Hui2*(1.Environment Research Institute, Shandong University, Jinan 250100, China；2.School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China；3.School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China). China Environmental Science, 2012,32(11)：2047～2052

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) accumulation and carbon consumption by Ralstonia eutropha H16 were investigated in anaerobic fermentative liquid (AFL) of waste activated sludge (WAS). The WAS was fermented at 52℃with a sludge retention time (SRT) of 48 hours in hydrolysis reactor to form AFL, in which the volatile fatty acids(VFAs) were feasible carbon source for PHAs synthesis. When acetic acid was the predominant component of VFAs in the AFL (C/N/P≈100/10/1,TOC＝2881mg/L, acetic acid/total VFAs=36.1%), R. eutropha H16 could utilize acetic acid and n-butyric prior to other VFAs for cell growth and PHAs synthesis, and the major monomer of PHAs was hydroxybutyrate (HB). Propionic and n-valeric acid were utilized at 20～40 hours after inoculation as hydroxyvalerate (HV) monomer content increasing. The maximum PHAs content detected in the cells was 12.51% (dry weight) after 40-hour reaction, and then iso-butyric and iso-valeric acid were utilized but both PHAs synthesis and cell growth decreased. When iso-valeric acid was the predominant VFA in the AFL (C/N/P≈100/10/1, TOC＝2358mg/L, iso-valeric acid/total VFAs=29.0%), the maximum PHAs content detected in the cells was up to 32.14% (dry weight) at 24-hour of growth and hydroxyvalerate (HV) was the major monomer of PHAs.

polyhydroxyalkanoates(PHAs)；Ralstonia eutropha H16；waste activated sludge(WAS)；anaerobic fermentative liquid (AFL)；volatile fatty acids(VFAs)

2012-03-22

國家水污染治理重大專項資助項目(2009ZX07313-003);清華大學校自主研究基金項目(2010THZ02)

* 責任作者, 教授, wanghui@tsinghua.edu.cn

X705

A

1000-6923(2012)11-2047-06

盛欣英(1986-),女,山東青島人,山東大學環境研究院碩士研究生,主要從事剩余污泥合成PHAs的研究.