中東部湖區營養物基準推薦值的生態毒理學評價

郭佳林，胡翔*，歐陽洋，霍守亮

1.北京化工大學化學工程學院，北京 100029

2.中國環境科學研究院，北京 100012

隨著我國經濟持續快速的發展，以及工業化、城市化、農業現代化不斷地加快，大量氮磷等營養物進入湖泊江河流域，導致湖泊水體環境不斷惡化、水華頻繁發生、生物多樣性下降，湖泊水生態安全受到嚴重威脅。為保障湖泊水生態系統健康，防止發生藍藻暴發等不良水體生態效應，湖泊水體富營養化預防與控制逐漸成為我國重點研究和亟須解決的重大環境問題［1］。國家環境管理的創新跨越和環境戰略目標的實現，亟需適合中國區域特點的水環境基準作為科學依據，而湖泊水環境基準方面的系統研究剛開始起步。我國中東部湖區屬于湖泊營養物一級生態分區，研究中東部湖區營養物基準體系十分必要。

營養物是湖泊水生生物和健康生態系統所必需的，但是營養物過量會導致湖泊富營養化［2］。營養物基準是指“以保護人類健康和生態平衡為目的，用可信的科學數據表示水中營養物質的允許濃度或能間接表示水中營養物濃度的相關理化和生物指標的數值”［3］。在制定營養物基準方面，美國的水質基準被認為是目前最為完善和最具有科學性的［4］，其初步形成了分區分級的營養物基準體系，其一級分區營養物基準采取了四個指標:總磷(TP)濃度、總氮(TN)濃度、葉綠素 a(Chl-a)濃度和透明度(SD)［5-6］。

美國國家環境保護局(US EPA)主要利用參照狀態法確定湖泊營養物基準值［5］，Kenney 等［7］在參照狀態法基礎上提出通過建立結構方程模型和專家判斷確定華盛頓湖等湖泊營養物基準值。國內一些學者通過借鑒參考美國的方法，確定出我國中東部湖區的營養物參照狀態值［8］，在其基礎上通過結構方程模型(SEM)得出營養物候選基準值;霍守亮等［9］研究分析了我國湖泊營養物基準指標候選變量，并歸納了選擇營養物基準指標時應遵循的一些原則。筆者在其基礎上分析中東部湖區湖泊特點，根據結構方程模型(SEM)得出的營養物候選基準值，選取TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度和SD作為中東部湖區營養物基準值的候選指標，由于SD指標的模擬較為困難，因此在實驗室中只選取TP濃度、TN濃度和Chl-a濃度來模擬我國中東部湖區的水質狀況。

枝角類是水體浮游動物的重要類群，能攝食微囊藻，研究其與微囊藻的生態關系非常必要，對枝角類毒性方面的研究工作已有較多報道［10］，其中大型溞是國際通用的毒理學試驗標準模式動物，其生長繁殖速度快且易于培養，對環境條件變化敏感性高。在水生生物生態毒理試驗研究方面，國內外不少學者應用大型溞進行慢性毒性試驗［11-13］。因此，筆者以大型溞(Daphnia magna)為試驗對象，通過觀察其生長、繁殖情況對我國中東部平原湖區進行生態毒理學評價。

1 材料和方法

1.1 材料

有毒銅綠微囊藻和斜生柵藻由中國環境科學研究院提供，均為單細胞培養物。用M11培養基進行擴大培養，溫度為27℃，表面光照強度為2000 lx，光暗比為16∶8。大型溞由中國環境科學研究院提供，在實驗室進行純化培養，溫度為23℃，表面光照強度為2000 lx，光暗比為16∶8，試驗所用的大型溞為第三代成熟期大型溞。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗

TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度、SD和pH是湖泊營養物基準體系的重要指標，由于實驗室中SD指標的模擬較困難，因此，選取 TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度和pH四項指標研究各變量對大型溞存活繁殖狀況的影響，并確定各變量指標的最優值。

1.2.2 模擬中東部湖區試驗

根據單因素試驗結果，共設3個試驗組和1個對照組，3個試驗組的水質條件分別對應所選3個基準候選值(E1、E2和E3)，其水質條件如表1所示。在3個試驗組中加入有毒銅綠微囊藻;對照組中加入斜生柵藻(無毒)取代有毒的銅綠微囊藻，對照組水質條件與試驗組1相同。將配好的溶液分別裝入4個1 L的燒杯中。隨機選取30只已培養的第三代成熟期大型溞分別放入上述4個燒杯中。試驗開始時，每天早晚給各組加入20 mL密度為4×106個/mL的斜生柵藻，以補充充足的餌料，統計大型溞的個數和新生幼溞個數，并及時將各燒杯中新生的幼溞移出。每組試驗設5個重復，每組結果取5個重復試驗結果的平均值。

表1 試驗水質Table 1 The water quality of the experiments

2 結果

2.1 TP濃度的影響

保持TN濃度(0.72 mg/L)和Chl-a濃度(3.6 mg/m3)不變，TP濃度分別為0.030，0.036和0.042 mg/L，試驗結果如圖1所示。TP濃度為0.036 mg/L的大型溞存活率〔圖1(a)〕明顯高于其他2個濃度＞u0.05)，TP濃度為0.030和0.042 mg/L的大型溞間沒有明顯的差異性(＜u0.05)。同樣，TP濃度為0.036 mg/L的大型溞出生率〔圖1(b)〕明顯高于其他2個濃度(＞u0.05)，而TP濃度為0.030和0.042 mg/L的大型溞出生率間差異性不明顯(＜u0.05)。從圖1(a)可以看出，雖然這3個濃度的大型溞存活率都是從第3天開始出現較大幅度的降低，但從最終結果來看，與其他2個濃度的大型溞相比，TP濃度為0.036 mg/L的大型溞存活率相對較高，為40%。從圖1(b)可以看出，TP濃度為0.036 mg/L的大型溞第一次繁殖的時間為第8天，出生率為50%;而 TP濃度為0.030和0.042 mg/L的大型溞第一次繁殖時間分別為第10天和第11天，大型溞出生率也明顯低于TP濃度為0.036 mg/L。由此可見，TP濃度的最優值為0.036 mg/L。

圖1 TP濃度對大型溞存活率和出生率的影響Fig.1 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by total phosphorous

2.2 TN濃度的影響

控制TP濃度(0.036 mg/L)和Chl-a濃度(3.6 mg/m3)不變，TN濃度分別為0.60，0.72和 0.84 mg/L，試驗結果如圖2所示。

3個濃度的大型溞存活率〔圖2(a)〕從一開始就沒有明顯的差異性(＜u0.05)，但從大型溞出生率〔圖2(b)〕看，TN濃度為0.72 mg/L與其他2個濃度有明顯的差異性(＞u0.05)，而其他2個濃度間沒有明顯的差異性(＜u0.05)。從圖2(a)可以看出，TN濃度為0.72 mg/L的大型溞存活率從第3天開始高于其他2個濃度，最后趨于穩定，為40%。從圖2(b)可以看出，TN濃度為0.72 mg/L的大型溞第一次繁殖時間為第8天，早于其他2個濃度;而出生率也明顯高于其他2個濃度，為40%。由此可以得出，TN濃度最優值為0.72 mg/L。

2.3 Chl-a濃度的影響

圖2 TN濃度對大型溞存活率和出生率的影響Fig.2 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by total nitrogen

保持TP濃度(0.036 mg/L)和TN濃度(0.72 mg/L)不變，Chl-a濃度分別為 3.0，3.6和 4.2 mg/m3，試驗結果如圖3所示。從大型溞的存活率〔圖3(a)〕來看，3個濃度間沒有顯著差異性(＜u0.05)，但從大型溞的出生率〔圖3(b)〕可以看出，Chl-a濃度為3.6 mg/m3與其他2個濃度間有明顯的差異性(u0.05)，同時Chl-a濃度為3.0和4.2 mg/m3間也有明顯的差異性(＞u0.05)。從圖3可以看出，雖然3個濃度的大型溞存活率差別不大，但Chl-a濃度為3.6 mg/m3的大型溞出生率要明顯好于其他2個濃度，由此得出，Chl-a濃度的最優值為3.6 mg/m3。

圖3 Chl-a濃度對大型溞存活率和出生率的影響Fig.3 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by chlorophyll-a

2.4 pH的影響

控制 TP濃度(0.036 mg/L)、TN濃度(0.72 mg/L)和Chl-a濃度(3.6 mg/m3)不變，以中東部平原湖區實際pH偏堿性為依據，選取pH分別為7.0，7.5和8.0，試驗結果如圖4所示。

圖4 pH對大型溞存活率和出生率的影響Fig.4 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by pH

2.5 大型溞的存活繁殖情況

根據單因素試驗結果，通過模擬中東部湖區試驗，得出大型溞的存活率和出生率如圖5所示。在不同的基準候選值水質條件下喂養大型溞，對比試驗組和對照組發現，各試驗組與對照組間的存活率差異性顯著(u0.05)，E2組的存活率與E1和E3組的差異性明顯(u0.05)，但是E1和E3組間的差異性不明顯(＜u0.05)。同樣，大型溞出生率的差異顯著性與存活率一致。從圖5(a)可以看出，在14 d內對照組中大型溞的存活率明顯趨于穩定，大型溞沒有大幅死亡現象;而試驗組有所不同，E1、E2和E3組大型溞在第4天后其存活率開始急劇降低，其中E3組的存活率降低最為明顯。在經過9 d后，由于大型溞對毒性環境的適應，其存活率基本趨于穩定，最終E2組大型溞的存活率相對較高，約為26%。通過對比對照組和試驗組的大型溞繁殖狀況〔圖5(b)〕可以看出，對照組的繁殖能力明顯優于試驗組，對照組的出生率達到了70%，并且第一次繁殖時間僅為3 d。而試驗組第一次繁殖時間在8 d后才開始，并且出生率也非常低，最高的是E2組，為33%，最低的是E3組，僅為10%。

圖5 大型溞的存活率和出生率Fig.5 Survival proportion and natality of Daphnia magna

3 討論

在模擬中東部湖區試驗中，通過對比可以看出，大型溞在對照組中基本保持較高的存活率，而在其他3個試驗組中的存活率明顯較低，這主要是由于有毒銅綠微囊藻的抑制作用，這種抑制可能是銅綠微囊藻產生的藻毒素對大型溞生理代謝活動產生的負面作用引起的。一般認為，藻毒素對真核生物的毒性機制在于藻毒素可特異性地抑制絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷脂酸合成酶1和2A(PP1和 PP2A)［14］。而PP1和PP2A參與許多重要的胞內過程，如細胞生長、分化、蛋白質合成、細胞信號轉導等［15］，并且由于對PP1和PP2A活性的抑制，相應地增加了蛋白激活酶的活性，導致細胞內多種蛋白質的過磷酸化，造成細胞骨架系統架構破壞，致使細胞畸形［16］。此外Lürling等［17］認為，在非常低濃度的范圍內藻毒素對大型溞產生的影響不是隨著濃度的升高而增大，同時銅綠微囊藻不但能夠產生藻毒素，而且還會分泌出其他生物活性物，這樣在較低的濃度下，該生物活性物可能會對大型溞產生較為有利的影響。除此之外，由于低濃度磷氮的存在，也會對大型溞產生影響。比較3個試驗組的試驗結果發現，E2組大型溞的存活率和出生率是最好的(圖5)。另外試驗還發現，在有毒銅綠微囊中大型溞產第一胎時間比對照組晚很多，這也是由于試驗組中銅綠微囊藻的毒性作用所致。Guo等［18］在試驗研究中也認為，微囊藻毒素的濃度越高對大型溞的出生繁殖影響也就越大。

由于營養物基準值是在非常低的濃度范圍內，大型溞在該范圍內所受到的不利影響與濃度的高低不成正相關，此外還受到銅綠微囊藻分泌物的影響，從單因素變量影響的試驗結果發現，其TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度和pH的最佳指標值分別為0.036 mg/L，0.72 mg/L，3.6 mg/m3和 7.5。與此同時，在模擬中東部湖區營養物基準值的試驗中，E2組大型溞的存活和繁殖狀況在各試驗中均為最佳，試驗得到的營養物基準最優值與單因素變量試驗結果最優值相一致，因此，初步確定了中東部湖區的營養物基準值:TP濃度為0.036 mg/L;TN濃度為0.72 mg/L;Chl-a濃度為3.6 mg/m3。

4 結論

(1)在單因素試驗中，通過比較大型溞的出生率和存活率，在其他因素不變時，確定了各單因素的最優值:TP濃度為0.036 mg/L，TN濃度為0.72 mg/L，Chl-a濃度為3.6 mg/m3和pH為7.5。

(2)通過中東部湖區營養物推薦值水質條件模擬試驗，分析各試驗組大型溞的出生率和存活率得出，E2組大型溞的存活發育狀況優于E1和E3組，初步確定了中東部湖區的營養物基準值:TP濃度為0.036 mg/L;TN濃度為0.72 mg/L;Chl-a濃度為3.6 mg/m3。

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