輪狀病毒VP 7 -U 基因在胡蘿卜中表達的免疫原性分析

劉滿杏，李 霞，劉榮堂，楊 慧，趙 麗，李 鵬

（1.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070；2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京100097）

腹瀉是一類危害人類健康的嚴重傳染病，約50%的嬰幼兒秋冬季腹瀉是由輪狀病毒引起的。輪狀病毒是一種腸道病毒，屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬［1］，主要以糞-口途徑傳染，在人類手上能存活數(shù)小時，而在無生命表面能存活數(shù)天，并能抵抗一般消毒劑［2］。在發(fā)達國家和發(fā)展中國家輪狀病毒的發(fā)病差別不大，不太可能通過改善環(huán)境衛(wèi)生和營養(yǎng)狀況使之降低［3］。輪狀病毒二十面體，帶有3層結構的衣殼蛋白，外層包括VP4和VP7［1］，內層是VP6，核心層是VP1、VP2和VP3。目前缺乏治療性藥物，口服補藥是首選的治療方法。VP7蛋白占病毒粒的30%［4］，是病毒的主要外殼糖蛋白，決定病毒的血清型，并可誘導中和抗體，是輪狀病毒基因工程疫苗研究的首選。因為VP7基因是輪狀病毒的一個亞基，因此不會對人體造成過度刺激，理論上不會產生致病反應。在轉基因植物疫苗的生產和傳輸方面，植物作為生物反應器的潛力是巨大的，但是轉基因植物目的抗原的表達量有待于進一步提高。到目前為止，已轉化口服疫苗成功的植物有煙草（Nic-otianatabacum）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）、番茄（Lycopersiconesculentum）、香蕉（Musaparadisiaca）、萵苣（Lactucasativa）、羽扇豆（Lupinus polyphyllus）、菠菜（Spinaciaoleracea）、玉米（Zea mays）、苜蓿（Medicagosativa）等。煙草易于轉化和繁殖，但其組織中含有大量的生物堿。馬鈴薯也容易轉化，但人們一般只吃熟馬鈴薯。利用可直接生食的植物是未來生產口服疫苗的必然趨勢，胡蘿卜（Daucuscarota）可生食，易運輸，耐儲存及蛋白含量高等優(yōu)點使其不可避免地成為植物受體系統(tǒng)的理想選擇［5］。

胡蘿卜是一種兩年生草本植物，傘形科胡蘿卜屬，其營養(yǎng)豐富，被稱為健康的功能食品。轉基因胡蘿卜不管從營養(yǎng)上還是外形上都與正常胡蘿卜差異不大。目前，有人利用轉基因胡蘿卜表達肺結核疫苗［6］，鄭回勇等［7］將人乳鐵蛋白基因轉入胡蘿卜，為其添加新的營養(yǎng)保健因子，同時對增強植株抗性具有重要意義。根據(jù)VP7-U基因在植物表達中的需求，優(yōu)化部分VP7基因的密碼子，期望能夠增加VP7蛋白在植物中的表達量。本研究將VP7-U基因轉化到胡蘿卜中，檢測VP7-U基因在轉基因胡蘿卜中的表達及其免疫原性。

1 材料與方法

1.1 材料VP7-U基因表達載體，由中國科學院微生物所構建；VP7-U胡蘿卜種子和黑田五寸種子由中國農業(yè)科學院提供；BALB／c小鼠購自中國農科院動物中心。

Tag酶購自天根生化和全式金公司，反轉錄試劑盒購自promega和全式金公司，蛋白Maker購自MBI和天根生化公司，弗氏佐劑構自Sigma公司，羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP分別購自博士德公司和中杉金橋公司。小牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自天根生化公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購自天根生化公司。PCR引物由奧科生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 胡蘿卜陽性植株的種植 種植VP7-U胡蘿卜傳代種子，對轉基因胡蘿卜植株進行傳代，在胡蘿卜植株10cm左右時，取新鮮胡蘿卜葉子提取DNA進行PCR檢測，初步篩選培育VP7-U胡蘿卜陽性植株。

1.2.2 PCR引物擴增 VP7-U正向引物：AGGATCTATGGACACTG，反 向 引 物：ATTAGATCCACCAACTTG；在25μL體系中，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5mmol·L-1）1.0μL，引 物 （0.01 mmol·L-1）各0.5μL，模板 DNA 1μg，Tag酶（2.5 U）0.8μL，補雙蒸水至25μL。PCR擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性50s、50℃退火60s、72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。

1.2.3 轉VP7-U基因胡蘿卜的Western Blot

轉基因胡蘿卜蛋白的提取：取新鮮的轉基因胡蘿卜根0.4g，用液氮冷凍研磨成粉末，加入200μL蛋白提取緩沖液，2～3h樣品充分溶解后，4℃，12 000r·min-1，離心20min。取上清液備用。

SDS-PAGE和蛋白質的電轉印：用8%的SDS-聚丙烯酰胺分離膠和5%的濃縮膠，20mA，2h。待蛋白Maker完全分離后進行電轉印。醋酸纖維素膜，伯樂電轉儀60V，3h轉膜，轉膜后用3%BSA封閉，4℃過夜，PBST洗滌3次后加入一抗室溫孵育2h，再次洗滌3次后加入辣根過氧化物標記的二抗孵育2h，洗滌后用DAB顯色液染色。

1.2.4 轉基因胡蘿卜中VP7-U蛋白免疫原性及濃度的檢測 以輪狀病毒VP7基因蛋白為陽性并按一定配比稀釋，以黑田五寸為陰性對照，樣品胡蘿卜蛋白以1／50倍比稀釋，每個濃度做3次平行，3%BSA封閉，一抗用兔抗VP7血清，二抗用辣根過氧化酶標記的山羊抗兔血清，酶聯(lián)反應后洗滌，DAB顯色后加入1mol·L-1的鹽酸終止反應。于酶標儀在A450nm，A655nm讀取數(shù)值。根據(jù)VP7陽性蛋白稀釋比做標準曲線，根據(jù)標準曲線測定胡蘿卜蛋白中目的蛋白的含量，并計算出所占胡蘿卜總蛋白的比例。

1.2.5 轉基因胡蘿卜目的蛋白抗原性的檢測

免疫小鼠：利用提取的胡蘿卜蛋白灌服4周齡的小鼠，4只為一組。目的蛋白量20～30mg，同時保證陰性蛋白和陽性蛋白的總蛋白量相同，免疫周期為1周。免疫4次后7d采血，3 000r·min-1，10min，4℃離心，取血清，ELISA方法檢測不同小鼠體內的IgG含量，并計算出每組小鼠的OD值平均值。

2 結果分析

2.1 pBI121S.P.VP7-U構建圖 其啟動子為35S啟動子，VP7基因前有一段煙草S.P（圖1）。

圖1 pBI121S.P.VP7 -U 構建圖Fig.1 Construction for pBI121S.P.VP7-U

2.2 PCR 利用特異性引物對目的基因進行擴增，結果可以擴增出621bp的目的片段（圖2）。

2.3 Western Blot 由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果可以明顯地看出37KD處的目的蛋白條帶，說明目的基因在蛋白水平上有表達（圖3）。轉膜后利用兔抗VP7為一抗（中國科學院微生物研究所贈），山羊抗兔-HRP為二抗孵育，DAB染色后可明顯看到37KD處的目的蛋白印記，進一步說明優(yōu)化后的VP7基因在蛋白水平上得到表達（圖4）。

圖2 部分轉VP7 -U 基因胡蘿卜株PCR結果Fig.2 PCR detection of carrots transformed VP7 -U gene

圖3 8%SDS-PAGE分離胡蘿卜根部蛋白結果Fig.3 Detection of carrot root protein with 8%SDS-PAGE

圖4 胡蘿卜根部蛋白的轉膜結果Fig.4 Analysis of protein in carrot root with Western Blot

2.4 目的基因在轉基因胡蘿卜中的表達量比較轉基因與非轉基因胡蘿卜的測定結果，轉基因胡蘿卜的OD值明顯高于陰性對照，說明轉基因胡蘿卜蛋白中含有免疫活性的抗原蛋白（圖5）。以細菌陽性蛋白做標準曲線，根據(jù)標準曲線得出各個轉基因胡蘿卜中的抗原含量，選取最高OD值的植株為灌服材料，并根據(jù)BCA試劑盒得出該植株可溶性總蛋白的含量，確定小鼠的灌服量，同時計算出該植株所含目的抗原在其可溶性總蛋白中的比例（表1）。隨機選取轉VP7-U基因胡蘿卜與轉VP7基因胡蘿卜6株，通過ELISA檢測后分別得出OD值平均值，并與陰性對照比較，結果表明，轉VP7-U基因胡蘿卜的活性抗原蛋白含量要高于轉VP7基因的胡蘿卜（圖6）。

圖5 ELISA檢測活性目的抗原結果Fig.5 Detection of active antigen with ELISA

表1 喂服小鼠的抗原量及胡蘿卜蛋白總量Table 1 Amount of antigen and carrot total protein given to mice

2.5 灌服不同蛋白的小鼠體內的IgG比較結果表明，灌服陽性胡蘿卜蛋白的IgG高于未灌服和灌服陰性胡蘿卜蛋白的兩組（圖7）。

3 討論

輪狀病毒導致嬰幼兒腹瀉，目前還沒有可有效治療的藥物。疫苗預防接種是遏制輪狀病毒腹瀉唯一的有效手段，而轉基因植物口服疫苗是一種非常有前景的新型疫苗。口服疫苗到達腸內粘膜誘導部位之前要經(jīng)過胃腸內的不利環(huán)境，所以必須要受到保護，否則會失去免疫性［8］。而植物細胞壁作為天然的生物膠囊，可使細胞中的疫苗抗原通過胃內的不利環(huán)境時受到細胞壁的保護，直接到達腸內黏膜誘導部位，誘導黏膜和全身免疫反應。不僅如此，轉基因植物口服疫苗還可誘導消化道相關淋巴樣組織（GALT）產生分泌性的IgA（sIgA），在病原體和宿主之間相互作用的起始部位直接誘發(fā)免疫反應，從而大大提高其免疫有效性［9］。利用轉基因植物生產出來的口服疫苗要經(jīng)過動物和人體試驗，以驗證其能否引起機體產生免疫反應，一般先要經(jīng)過小鼠試驗。實驗中將轉基因植物提取液對小鼠進行灌胃或提取轉基因植物中表達的抗原注射小鼠［10-12］，檢驗小鼠血清中是否存在抗體。

圖6 轉VP7 基因和VP7 -U 基因胡蘿卜的ELISA結果Fig.6 ELISA detection to carrots transformed VP7 gene and VP7 -U gene

圖7 灌服不同蛋白的小鼠體內的IgG平均含量比較Fig.7 Comparison of IgG in different mice gave different proteins

本研究以胡蘿卜為植物受體，整合優(yōu)化的人源輪狀病毒VP7基因，經(jīng)過PCR初步檢測，Western blot和ELISA蛋白水平上的檢測后［13］，將有蛋白表達的轉基因胡蘿卜提取液灌服4周齡小鼠，結果表明，灌服VP7陽性細菌蛋白的4只小鼠中有3只的IgG明顯高于灌服陰性胡蘿卜蛋白的小鼠；灌服陽性胡蘿卜蛋白的3只小鼠中，兩只小鼠的IgG明顯高于灌服陰性胡蘿卜的小鼠，比灌服陽性細菌蛋白的小鼠的IgG含量低，但陽性小鼠同陰性小鼠體內的IgG含量差異不顯著。其原因除了小鼠個體差異，還可能是因為陽性細菌蛋白的純度較高，而所用的灌服蛋白是提取的胡蘿卜粗蛋白，存在一定量的雜蛋白，同時胡蘿卜蛋白中部分雜蛋白的分子量和蛋白結構可能與抗原蛋白相近，減少了抗原蛋白在胡蘿卜可溶性蛋白中的相對含量。由于細菌蛋白制備成口服疫苗還需要復雜的后加工過程，并且不能在室溫下保存，運輸利用也需要一定的條件；而轉基因胡蘿卜中的抗原由于胡蘿卜生物系統(tǒng)的保護，相較于細菌來說可長期具有生物活性，并且耐儲存、易運輸?shù)忍攸c凸顯了轉基因胡蘿卜的優(yōu)勢。本研究用ELISA法檢測插入胡蘿卜中優(yōu)化的VP7蛋白同時得出其濃度，結果表明，優(yōu)化后的VP7蛋白在可溶性蛋白中的比例要高于正常的VP7蛋白所占的比例，在一定程度上提高了抗原量。雖然轉基因胡蘿卜口服疫苗制作還有很多問題和困難，但隨著研究的不斷深入，通過生食一根胡蘿卜而預防輪狀病毒的構想在不久的將來終會實現(xiàn)。

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