寧夏苦馬豆內生真菌的分離與鑒定

趙清梅，余永濤，貝盞臨

（1.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏 銀川750021；2.國家民委發酵釀造工程生物技術重點實驗室，寧夏 銀川750021；3.寧夏大學農學院，寧夏 銀川750021）

苦馬豆（Swainsonasalsula），又名羊尿泡、馬尿泡、紅花苦豆子、毒豆等，為豆科苦馬豆屬有毒植物，廣泛分布于新疆、甘肅、青海、寧夏、內蒙古等西北地區［1-2］?？囫R豆中含有一種三羥基吲哚里西啶生物堿，它能抑制細胞溶酶體α-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性［3-4］，導致動物中毒，因該生物堿分離于苦馬豆，故稱為苦馬豆素（Swainsonine，SW）［5］。動物過量采食苦馬豆，導致細胞低聚糖代謝和糖蛋白合成發生障礙，引起細胞內甘露糖積聚，致使細胞空泡變性和功能紊亂，中毒嚴重的家畜會發生死亡［3-4］。

據報道，苦馬豆素也是棘豆屬和黃芪屬有毒植物（瘋草）的主要毒性成分［6］，瘋草的毒性與其內生真菌（Undifilumoxytropis）產生的苦馬豆素有關［7-10］。但目前，還未見到關于苦馬豆內生真菌的研究報道，苦馬豆內生真菌的種屬分類還不清楚，故無法確定其毒性是否也與內生真菌的共生有關。研究表明，諸多植物內生真菌可以合成宿主植物中的生物活性物質［11-13］?？囫R豆中含有黃酮類、甾醇類、萜類、生物堿類等多種具有生理活性功能的化合物，民間用于治療腎炎、肝炎等，具有重要的藥用價值［14］，但其內部共生的內生真菌是否也能夠合成這些生物活性物質，仍需進一步研究。本研究對在寧夏采集的野生苦馬豆的內生真菌進行分離、培養和種屬分類鑒定，以期為苦馬豆內生真菌活性成分的研究、開發和利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料 苦馬豆植株于2011年6-7月分別采于寧夏蘇峪口國家森林公園和寧夏平羅縣二閘鄉，植株未表現出任何病害癥狀。每處各采集全株植物樣品12株，其中10株于24h內進行內生真菌分離，2株壓制成標本由寧夏大學草業科學研究所李小偉副教授鑒定并確定為野生苦馬豆。

1.2 主要儀器和試劑 PTC 200型PCR儀和Gel Doc XR凝膠成像系統，美國BIO-RAD公司生產；SSX-550掃描電子顯微鏡，日本島津公司生產；TakaRa Universal Genomic DNA Extraction kit Ver.3.0DNA提取試劑盒、TakaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0瓊脂糖凝膠回收試劑盒、TakaRa Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體等分子生物學試劑，均購自大連寶生物工程公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 植物樣品的表面消毒與內生真菌的分離培養 首先用去離子水沖去苦馬豆表面附著的泥土，再將苦馬豆的葉、莖、種子和根分離并用滅菌紗布包裹，然后按照余永濤等［15］的植物表面消毒方法對苦馬豆的各組織塊進行表面消毒，具體消毒程序為75%乙醇浸泡20s，1%的次氯酸鈉溶液浸泡3min，滅菌去離子水漂洗2次，每次1min。

用滅菌濾紙吸干消毒后的植物組織表面的水分，將各組織剪成3mm大小，然后分別接種于PDA瓊脂培養基、馬丁瓊脂培養基和沙氏培養基表面，置22℃條件下培養。待組織塊周圍長出真菌時，挑取菌落邊緣菌絲接種于新的PDA培養基表面純化培養，對各菌株編號。

1.4 分離菌株的形態觀察 將純化的內生真菌接種于馬鈴薯胡蘿卜培養基（PCA）平板上，置22℃條件下培養10～30d，挑取菌落邊緣菌絲，放入滴有水或棉藍乳酸酚染色液的載玻片上，置顯微鏡下觀察真菌菌絲、分生孢子、分生孢子梗的形態特征。切取PCA表面生長的真菌菌落，置于2%戊二醛溶液中固定過夜，經磷酸鹽緩沖液漂洗，丙酮逐級脫水，醋酸異戊酯置換后，將樣品真空干燥、粘貼、鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.5 真菌ITS序列的擴增和分析 挑取分離菌株的新鮮菌絲0.5～1.0g，經液氮研磨后，用DNA提取試劑盒提取真菌總DNA。擴增苦馬豆內生真菌的內部轉錄間隔區序列（ITS）所用引物為ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［16］。PCR反應體系為50μL：DNA聚合酶2.5U，10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）5μL，dNTP 4μL，引物各2μL，真菌DNA 0.5μL，加水至50μL；反應條件為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，循環次數為30；最后72℃10min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，切取擴增所得的500～700 bp的片段并純化回收。將回收產物與pMD19-T Vector連接，并將連接產物轉化DH5α大腸桿菌，菌落PCR法篩選含有轉化質粒的菌落，提取插入目的片段的質粒送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.6 真菌ITS序列分析和系統發育樹的構建登錄 http／／：www.ncbi.nlm.nih.gov，進入BLAST程序，將苦馬豆內生真菌的ITS序列與GenBank中的ITS序列進行同源性比較，并上傳序列獲得GenBank登錄號。應用Clustal W程序對苦馬豆內生真菌的ITS序列和GenBank中與苦馬豆內生真菌同源性較高的菌株的ITS序列進行排列。根據排列結果，應用MEGA 4.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.7 真菌的種屬分類 根據內生真菌的形態特征、系統發育分析結果，并結合文獻報道，對真菌進行種屬劃分。

2 結果與分析

2.1 內生真菌分離結果 接種于馬丁瓊脂培養基的組織塊，經1周培養后，在葉、莖的邊緣會長出白色的菌落，而種子和根中未長出真菌菌絲。從寧夏蘇峪口國家森林公園采集的樣品的葉和莖中僅分離到菌株SS＿NXA1，其在葉和莖中的分離率分別為40%和67%。從平羅縣采集的植物樣品的葉和莖中共分離到3株真菌，分別為SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2，其在葉中的分離率分別為27%、33%、53%，在莖中的分離率為40%、53%、60%。接種于PDA培養基和沙氏培養基的組織塊，經1周培養后，僅從平羅縣采集的植物樣品的葉和莖的個別組織塊邊緣能夠長出真菌菌落，經純化培養后僅得到菌株SS＿NXB1和SS＿NXG2，其中莖的在PDA培養基上的分離率分別為12%和10%，在沙氏培養基上的分離率分別為20%和27%。

SS＿NXA1菌株生長緩慢，在PDA培養基上的生長速度為0.6mm·d-1，起初菌落為白色，隨著培養時間的延長，菌落中央凸起，顏色逐漸加深，氣生菌絲呈致密的白色絨毛狀（圖1A）。SS＿NXB1（圖1B）、SS＿NXF1（圖1C）、SS＿NXG2（圖1D）菌株在PDA培養基上的菌落均為白色，菌落中央凸起，SS＿NXB1呈同心圓狀；隨著培養時間的延長，3株真菌的菌落底座會產生色素，SS＿NXB1為黃色，SS＿NXF1為褐色，SS＿NXG2為紫紅色；3株菌株的菌落形態和生長速度稍有不同，在PDA培養基上的生長速度分別為1.6、1.2和1.8mm·d-1。

各菌株的菌絲較細，具分支，在本研究中的各種培養基上培養均不產生分生孢子，但具有褐色球形或橢球形子囊殼，子囊殼大小為（60～90）μm×（30～50）μm；子囊內有無色的球形、橢球形或梭形的子囊孢子，大小為（2～3）μm×（1～1.5）μm（圖2A），但隨著培養時間的延長，該結構逐漸消失。SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2菌株在PCA培養基上經10～30d培養后，3株真菌均能由菌絲頂端產生分生孢子和分生孢子梗等無性繁殖結構，且分生孢子的形態相近。SS＿NXB1分生孢子梗無色，具橫隔，分支；分生孢子無色，頂生，單生，呈梭形，（1～2）μm×（0.5～1）μm（圖2B）。SS＿NXF1分生孢子梗呈褐色，不分支；分生孢子無色，頂生，多聚集成團，呈橢球形或梭形，（3～3.5）μm×（1～1.5）μm（圖2C）。SS＿NXG2分生孢子梗無色，具橫隔，少有分支；分生孢子無色，頂生，單生或聚集成團，呈球形、橢球形或梭形，（1.5～2）μm×（0.5～1.5）μm（圖2D）。內生真菌 SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2菌株與頭孢屬（Cephalosporium）或枝頂孢屬（Acremonium）真菌的形態特征相近［17-19］。

圖1 苦馬豆內生真菌SS＿NXA1、SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2在PDA培養基上的菌落Fig.1 The fungal colonies of SS＿NXA1、SS＿NXB1、SS＿NXF1and SS＿NXG2isolated fromSwainsona salsula on PDA

圖2 苦馬豆內生真菌SS＿NXA1、SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of SS＿NXA1、SS＿NXB1、SS＿NXF1and SS＿NXG2isolated fromSwainsona salsula

2.2 ITS序列擴增和分析結果 應用通用引物ITS1、ITS4，能有效擴增內生真菌SS＿NXA1、SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2的ITS序列，擴增產物經凝膠電泳分析，片段長度550～600bp，該片段包括ITS1、5.8SrDNA、ITS2的全部序列和18SrDNA、28SrDNA的部分序列。核苷酸序列測定結果顯示，SS＿NXA1、SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2菌株的ITS序列長度分別為550、589、585和586 bp，其ITS序列的GenBank登錄號分別為JX021665、JX021666、JX021667、JX021668。

BLAST比對結果顯示，SS＿NXA1菌株ITS序列與GenBank中ITS序列登錄號為EU480250（同源性99%）、FN392296（同源性96%）的菌株同源性最高，聚類分析結果也表明，SS＿NXA1菌株與EU480250、FN392296菌株親緣關系最近。SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2菌株的ITS序列與Acremoniumsp.CB90（HM989951）、Acremoniumsp.YT03（EF577237）、Acremoniumsp.XSD-85（EU326199）等枝頂孢屬菌株的ITS序列同源性高達99%，與Simplicilliumsp.KYK00030（AB378574）、SimplicilliumlanosoniveumCBS 962.72（EF641862）、Acremoniumsp.B26（HQ696028）、Cephalosporium lanosoniveum（AJ292396）等Simplicillium、枝頂孢屬和頭孢屬菌株的ITS序列同源性高達98%。NJ系統發育分析結果表明，SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2菌株與Acremoniumsp.YT03（EF577237）、Acremoniumsp.CB90（HM989951）、Acremoniumsp.XSD-85（EU326199）、Acremoniumsp.B26（HQ696028）等枝頂孢屬真菌同在一個分支上，其自檢支持率高達72%，可以進一步確定，菌株SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2與枝頂孢屬真菌的遺傳關系較近（圖3）。

圖3 由NJ法構建的ITS序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic trees generated from NJ analyses of the ITS genes of fungal endophytes from Swainsona salsula and related species selection

3 討論

苦馬豆屬植物全世界有2種，我國僅有1種，為苦馬豆，廣泛分布于西北各省區［1］。放牧家畜過量采食苦馬豆會造成中毒死亡。Colegate等［5-6］的研究表明，澳大利亞灰苦馬豆（S.canescens）中含有吲哚里西啶生物堿——苦馬豆素，它是導致動物中毒的主要原因。我國青海省也發生過綿羊苦馬豆中毒死亡，中毒動物的臨床癥狀和病理變化與灰苦馬豆中毒相似［20］。王凱等［21］對引起中毒的苦馬豆化學成分進行了分析，確定其內部也含有苦馬豆素。研究表明［7-8］，瘋草中普遍共生的Undifilum內生真菌能夠產生苦馬豆素?？囫R豆也含有苦馬豆素，其內部是否也存在能夠產生苦馬豆素或其他生物活性物質的內生真菌尚未見報道。

本研究從無病害的野生苦馬豆中共分離到4株內生真菌，在經表面消毒處理的葉和莖中的分離率較高，而在種子和根中，經反復培養仍未長出菌絲，結果表明該類內生真菌可能具有組織專性寄生的特點，主要寄生于苦馬豆的葉和莖內。內生真菌SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2的形態相近，均具有頭孢屬或枝頂孢屬真菌的形態特征，其ITS序列與枝頂孢屬、頭孢屬和Simplicillium菌株的同源性較高，基于ITS序列構建的系統進化樹也表明SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2與枝頂孢屬真菌的遺傳進化關系最近。由于頭孢屬與枝頂孢屬的形態特點相同，而枝頂孢屬發表較早，故Gams［17］認為頭孢屬真菌是枝頂孢屬真菌的同物異名。Zare和Gams［22］又采用分子生物學鑒定方法把頭孢屬中的一些真菌重新劃分為Simplicillium，但董慶霖等［23］仍認為，Simplicillium和頭孢屬真菌都為枝頂孢屬的同物異名。因此，根據內生真菌的形態特征、遺傳進化分析結果及文獻報道，本研究將內生真菌SS＿NXB1、SS＿NXF1、SS＿NXG2均劃分為枝頂孢屬真菌。菌株SS＿NXA1具有有性態的子囊殼結構，與余永年等［24］從苦馬豆中分離的束絲殼屬真菌苦馬豆束絲殼（Trichocladiaswainsoniae）的形態較為接近，但在本研究中未見到附屬絲等有性態結構和分生孢子、分生孢子梗等無性態結構，隨著培養時間的延長，菌株SS＿NXA1的子囊殼結構逐漸消失，仍不能確定該菌株是否屬于束絲殼屬真菌；此外，GenBank數據庫中ITS序列同源性與SS＿NXA1較高的菌株（EU480250）也未進行種屬劃分，故未能對SS＿NXA1菌株進行種屬分類，SS＿NXA1菌株的種屬劃分依賴于進一步對其培養特性、形態結構、遺傳發育等的深入研究。

枝頂孢屬真菌是一類分布廣泛的真菌，其中很多菌株都是植物內生真菌，如蛇足石杉（Huperzia serrata）［25］、見血封喉（Antiaristoxicaria）［26］、白木香（Aquilariasinensis）［27］等植物中均分離到與宿主植物的化學物質合成等密切相關的枝頂孢屬內生真菌。枝頂孢屬真菌可產生酚類、萜類、環肽、蒽醌類、生物堿類等次生代謝產物，有些產物危害人畜和植物，對人類健康、畜牧和農作物生產造成危害，但有些次生代謝產物可抗菌消炎、防治人畜疾病和抵御植物病害，因此枝頂孢屬真菌已成為人類開發新型藥物的重要微生物資源［28-30］。本研究首次報道苦馬豆內生真菌，并確定其主要為枝頂孢屬真菌，這些真菌是否產生苦馬豆素或其他具有生物活性作用的次生代謝產物有待進一步研究。

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