用Candida lipolytica脂肪酶手性轉酯拆分農藥中間體rac-1-苯乙醇

范衛東，范永仙，陳小龍

(1.浙江工業大學 生物與環境工程學院 發酵工程研究所，浙江 杭州 310014;2.浙江天新藥業有限公司，浙江 天臺 317200)

隨著生命科學的進一步發展，人們已充分認識并開始重視手性藥物異構體在生物體內代謝、藥理作用、臨床效果和毒副作用的差異［1］。研究表明，以對映體純化合物給藥比其外消旋物療效更好、更安全［2］。因此，研究和分離手性化合物具有重要的學術意義和實用價值。光活性醇是精細化學品和藥物合成的重要中間體，在農藥、醫藥和化工等領域有著廣泛的應用［3］。其制備可以通過化學法或生物法拆分來獲得。由于生物法 (生物催化和生物轉化)拆分具有高效、反應條件溫和、高手性選擇性、對環境友好等原因，已引起廣泛關注［4-8］。1-苯乙醇是重要的有機化合物，可作為手性中間體被廣泛地應用于手性藥物或天然產物的合成［9］。由此可見，發展高效的不對稱合成方法來合成1-苯乙醇具有十分重要的意義。目前，利用脂肪酶高度的立體選擇性，在有機溶劑中進行轉酯化手性拆分制備單一手性醇 (酯)倍受人們的關注，特別是手性1-苯乙醇［10-12］。但所用的脂肪酶基本上是Novozym 435(Candida antarctica lipase B，CALB)，而利用其他來源脂肪酶來拆分手性醇比較少。本文比較了CALB和部分其他脂肪酶拆分1-苯乙醇，并使用C．lipolytica脂肪酶手性轉酯拆分rac-1-苯乙醇制備 (S)-1-苯乙醇，優化了脂肪酶在有機相中手性拆分1-苯乙醇的條件。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶及試劑

C．lipolytica脂肪酶 (北京凱泰新世紀生物技術有限公司)，Novozym 435(Novozymes)，豬胰脂肪酶 (Sigma-Aldrich)，擴展青霉脂肪酶 (福建龍馬生化廠)，黑曲霉脂肪酶 (深圳市綠微康生物工程有限公司)，rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯 (南京康滿林化工實業有限公司和江蘇永華精細化學品有限公司);所有其他化學試劑均為分析純。

1.2 轉酯化反應

如圖1所示，脂肪酶轉酯化反應的底物為rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯，經 C．lipolytica脂肪酶轉酯化反應，得到 (S)-1-苯乙醇、 (R)乙酸-1-苯乙酯和乙醛。

具體操作如下:取0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯乙醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯。以乙酸乙烯酯作溶劑，反應體系5 mL，10 mg C．lipolytica脂肪酶，置于30℃，150 r· min-1的搖床中進行轉酯化反應。

1.3 產物的分離與檢測

圖1 脂肪酶轉酯化反應

轉酯化反應每隔一定時間取樣，然后在樣品中加入一定比例的乙酸乙酯，振蕩萃取30 min，離心(12 000 r·min-1，5 min，4℃)分離，取上層有機溶液，用無水 Na2SO4干燥。產物乙酸-1-苯乙酯和未反應完全的底物1-苯乙醇用SP-6890型氣相色譜儀 (山東魯南瑞虹化工儀器有限公司，裝有手性毛 細 管 柱 Cyclodex-B，30 m×0.250 mm ×0.25 mm，FID檢測器)分析。色譜條件:柱溫使用程序升溫，初溫85℃維持3 min，升溫速率15℃·min-1，終溫140℃維持3 min;進樣器氣化溫度和FID檢測溫度分別為240℃和250℃;載氣N2， 流 量 3.0 mL·min-1， 分 流 比 50∶1， 樣 量0.4 μL，使用面積歸一化法分析。

轉化率/%=(初始底物峰面積-剩余底物峰面積)/初始底物峰面積×100。

初始底物峰面積=剩余底物峰面積+生成產物所需的底物的峰面積。

1-苯乙醇對映體過剩值 (e．e．值)/%=(S-1-苯乙醇的峰面積 -R-1-苯乙醇的峰面積)/(S-1-苯乙醇的峰面積 +R-1-苯乙醇的峰面積)×100。

2 結果與分析

2.1 不同來源脂肪酶拆分1-苯乙醇

取 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯，乙酸乙烯酯作 溶 劑， 反 應 體 系 5 mL， 搖 床 30℃，150 r·min-1。

由圖2可以看出，5種脂肪酶都有拆分能力。Novozym 435可將底物完全拆分，其次是假絲酵母脂肪酶，168 h時底物e．e．值達到19.01%，轉化率15.97%。但目前對Novozym 435的研究已經比較成熟，而對假絲酵母脂肪酶的催化拆分條件研究較少，所以本文采用假絲酵母脂肪酶作進一步的研究。

2.2 不同溶劑對反應的影響

圖2 不同來源脂肪酶對酯轉化的影響

各種溶劑的log P值和對脂肪酶轉酯化的影響分別如表1和圖3所示。表1和圖3可以看出，溶劑的疏水性系數對轉化率有一定的影響。除了正己烷以外，疏水性系數大于2.5的溶劑，168 h后轉化率均達到30%以上;正庚烷的轉化率最高為49.75%，1-苯乙醇e．e．值達到99.02%。故選擇正庚烷為溶劑。

表1 有機溶劑的log P

2.3 加酶量對反應的影響

如圖4所示，隨著加酶量的增加 (5～20 mg)，底物的轉化率穩步上升，72 h時轉化率從37.40%增加到50.00%，反應速率明顯提高。進一步增加酶量，72 h時，30 mg轉化率為43.21%，40 mg為48.30%，提高不明顯甚至有所下降。所以，從加快反應速率和節約脂肪酶兩方面綜合考慮，最佳加酶量為20 mg。經過酶量的優化，反應時間從之前的168 h大幅縮短到72 h。

圖3 有機溶劑反應的影響

圖4 脂肪酶加酶量對轉化率的影響

2.4 反應體系水活度對反應的影響

在酶促反應中，水活度對保持酶的活性和酶反應速率非常重要。實驗取20 mg C．lipolytica脂肪酶， 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯，正庚烷作溶劑，加入不同含結晶水的無機鹽來維持水活度搖床溫度30℃，轉速150 r· min-1(圖5-6)。

圖5 水活度對轉化率的影響

LiCl·H2O(Aw=0.023)水活度過低，脂肪酶失水而失活，轉化率只有4.54%;Na4P2O7·7H2O(Aw=0.47)、ZnSO4·7H2O(Aw=0.62)、Na2HPO4·12H2O(Aw=0.85)等水活度過高，影響了酶的均相分布。當水活度為0.35(CuSO4·5H2O)時，轉化率最高。

2.5 溫度對反應的影響

圖6 水活度對1-苯乙醇e．e．值的影響

酶反應溫度既影響反應速率，同時也影響酶活性。溫度越高，反應速度越快，酶失活越快。實驗取 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL) 乙 酸 乙 烯 酯，20 mg C．lipolytica脂肪酶，用正庚烷作溶劑，反應體系5 mL，水活度0.35。

25～45℃時，轉化率、1-苯乙醇 e．e．值和反應速率 (圖7-8)均隨溫度升高而上升，96 h轉化率從44.73%上升到49.86%，1-苯乙醇 e．e．值從80.93%上升到99.44%，45℃下僅48 h轉化率就達到49.84%。當溫度繼續上升時，轉化率和1-苯乙醇e．e．值開始下降，至55℃，96 h時僅剩43.84%。這與文獻［11-12］中描述的C．lipolytica脂肪酶在50～60℃失活一致。綜合考慮，溫度選擇45℃較為合適。

圖7 溫度對轉化率的影響

2.6 底物濃度對反應的影響

1-苯 乙 醇 濃 度 分 別 為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mol·L-1，乙酸乙烯酯濃度對應為0.1，0.2， 0.3， 0.4， 0.5 mol·L-1時， 放 入45℃，150 r·min-1的搖床中反應。

隨著 1-苯乙醇濃度從0.02 mol·L-1上升到0.08 mol·L-1，72 h時的轉化率一直維持在49.82% ～49.87%之間，1-苯乙醇 e．e．值也很高，但進一步提高 1-苯乙醇濃度為0.1 mol·L-1時，轉化率明顯下降至45.82%，1-苯乙醇 e．e．值也只有88.88%。所以0.08 mol·L-11-苯乙醇和0.4 mol·L-1乙酸乙烯酯為較合適的底物濃度 (圖9-10)。

圖8 溫度對1-苯乙醇e．e．值的影響

圖9 底物濃度對轉化率的影響

圖10 底物濃度對1-苯乙醇e．e．值的影響

3 小結

綜上可知，利用國產的C．lipolytica脂肪酶手性轉酯拆分rac-1-苯乙醇制備 (S)-1-苯乙醇是可行的，較佳反應工藝為:反應體系5 mL，正庚烷為溶劑，加酶量為20 mg，水活度為0.35，反應溫度45℃，rac-1-苯乙醇濃度為0.08 mol·L-1，乙酸乙烯酯為0.4 mol·L-1。經過優化，轉化率從15.97%上升到49.88%，(S)-1-苯乙醇 e．e．值

由于目前對C．lipolytica脂肪酶手性轉酯拆分rac-1-苯乙醇制備 (S)-1-苯乙醇研究比較少，對其酶動力學及動態拆分動力學等還有待進一步研究。

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