針刺對神經干細胞海馬內移植老年性癡呆大鼠行為學和NPY 表達的影響＊

楊春壯 馬 英 劉艷翠 徐永良 鄭海興 陸迪 任寶松 李俊俊 牡丹江醫(yī)學院（牡丹江157011）

老年性癡呆（Alzheimer Disease，AD）多發(fā)生在老年，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，其病因及發(fā)病機理尚不清楚，多種治療方法目前正在探索中。NSCs具有自我更新能力，并有向多細胞（神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等）分化的潛能［1］。目前NSCs對AD 的治療具有潛在的治療前景［2－3］。而針刺對NSCs移植后的影響文獻報道較少。本實驗采用β－AP向海馬CA1區(qū)定向注射制做AD 模型，利用體外分離培養(yǎng)的NSCs移植入AD 大鼠，探討針刺對NSCs移植后對AD 大鼠海馬NPY 表達的影響，改善AD 鼠的學習記憶能力。

1 材料和方法 1.1 儀器和試劑 KWD－808Ⅱ型電針儀（上海），腦立體定位儀，NPY 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基和B27無血清添加劑、表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、β—AP（美國Sigma公司）。

1.2 AD 動物模型的制備 健康成年雄性Wistar大鼠60只，體重（300±50）g［由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（黑）2008004］，隨機分為5組，正常對照組（正常組）12 只，其余單側（左側）海馬注射β－AP 制作AD 模型。制做癡呆模型后，將剩余48只隨機分成4組：模型組12只，針刺組12只，NSCs移植組（移植組）12只，移植后針刺組（移植針刺組）12只。大鼠用20%烏拉坦（0.55mL／kg）行腹腔注射，動物麻醉后采用平頭顱位固定于腦立體定位儀上，按腦立體定位圖譜（AP＝2.22mm ML＝3.0mm DR＝2.8mm）向海馬注射1μLβ—AP（恒溫培養(yǎng)箱37℃卵育1W，臨用前生理鹽水配制成5μg／μL濃度）。緩慢勻速推注，時間不少于5min，再留針3min。正常組不注射。

1.3 NSCs的分離和純化 取新生24h以內的Wistar大鼠在無菌條件下分離海馬，經胰蛋白酶消化、吹打制成單細胞懸液，以（4～6）×104／mL的細胞濃度加入含B27、表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）（終濃度均為10 ng／mL）的DMEM／F12無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每天鏡下觀察，待原代克隆形成后機械分離成單細胞懸液，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。以后每5～7d分離克隆傳代一次，方法同前。

1.4 海馬內NSCs移植 將傳至第4代的NSCs球懸液移入10mL的離心管內，吹打制成單細胞懸液，調整細胞濃度至1×104／μL 備用。動物模型建立后，行同側（左側）海馬NSCs移植。坐標為：AP＝2.22mm ML＝3.0mm DR＝2.8mm，用10μL的微量注射器吸取5μL 細胞懸液，將注射器固定于腦立體定位儀上，在20min內注射完畢，留針5 min。緩慢拔出針頭，縫合皮膚。

1.5 針刺方法 采用30號1寸毫針，選取大鼠百會、大椎、人中三個穴位，直刺0.5寸，接通KWD—808Ⅱ型電針儀，刺激參數：疏密波，頻率10Hz，電壓1.5V，留針10min，持續(xù)電刺激，每日1次，連續(xù)30d。

1.6 跳臺實驗 針刺后，隔日進行跳臺實驗。實驗時，將大鼠放入裝置中，使其適應3min，然后通以40V 交流電。大鼠受電擊后，其正常反應是跳到安全臺躲避電擊。記錄通電后大鼠受電擊至跳上跳臺的時間，作為反應期。

1.7 組織切片 跳臺實驗測試完畢后隔日麻醉動物，經左心室－升主動脈罐注200mL生理鹽水和250mL 含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（PB）。取腦后固定2～4h，依次入含15%蔗糖和30%蔗糖PB液中置4℃冰箱過夜，沉底備用。用冰凍切片機將海馬作冠狀連續(xù)切片，片厚5μm。

1.8 免疫組化步驟 ①脫蠟、水化組織切片。②3% H2O2去離子水孵育5～10min，阻斷內源性過氧化物酶。蒸餾水洗3次。③熱修復抗原：將切片浸入0.01M 枸椽酸鹽緩沖液（1000mL）蒸餾水中（C6H5Na3O7·2H2O 3g，C6H8O7·H2O 0.4g，PH 為6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復2 次。冷卻后0.1M PBS（100mL 蒸餾水中加NaCl 9g，NaHPO4·12H2O 6g，Na2HPO4·2H2O 0.4g，PH7.2～7.4）洗滌2次。④滴加一抗（兔抗大鼠NPY），工作濃度1：50，放入濕盒4℃過夜。⑤滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃30min。0.1MPBS洗2min×3次。⑥DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（ED1022）。取1mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C 試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在5～10min之間。蒸餾水洗滌。⑦蘇木素輕度復染脫水、透明、封片。顯微鏡觀察并拍照。

2 結 果 2.1 針刺后各組大鼠學習成績

表1 針刺后各組大鼠學習成績的比較（±s單位：s）

表1 針刺后各組大鼠學習成績的比較（±s單位：s）

與模型組比較△P＜0.05 與正常組比較▲P＜0.01

組 別n 反應期正常組12 5.25±4.71模型組12 10.68±8.96▲移植組12 6.76±10.65△針刺組12 5.91±6.21△移植針刺組12 5.76±7.52△

2.2 針刺對各組大鼠海馬NPY 表達的影響

表2 針刺對各組大鼠海馬NPY 表達影響的比較（±s mm2）

表2 針刺對各組大鼠海馬NPY 表達影響的比較（±s mm2）

與模型組比較△P＜0.01 與正常組比較▲P＜0.05與移植組比較◇P＜0.05

組 別n NPY 陽性細胞面密度正常組12 0.1084±0.0157模型組12 0.0711±0.0251▲移植組12 0.1263±0.0193△針刺組12 0.1128±0.0317△移植針刺組12 0.1580±0.0294△◇

3 討 論 老年性癡呆（AD）是由多種原因引起的腦退行性疾病，臨床常伴隨有學習記憶能力的下降，病理檢查發(fā)現海馬、皮層、杏仁核中NPY 免疫反應陽性神經元顯著減少，同時還伴有［3H］NPY 結合水平顯著下降［4］。現已知，NPY 是哺乳動物神經系統(tǒng)中含量最豐富的多肽之一，對動物的學習記憶過程有著明顯的調節(jié)作用［5］。NPY 在中樞神經系統(tǒng)中主要分布在大腦皮層、海馬結構、丘腦、下丘腦及腦干等處，尤以海馬結構中濃度最高，而海馬結構是調節(jié)學習和記憶的關鍵部位［6］。在海馬結構中，大量的NPY 神經元存在于CA1區(qū)的錐體細胞層、CA2與CA3區(qū)的多形層以及齒狀回的門區(qū)。已有多項研究結果發(fā)現，在伴有學習記憶損害的疾病中可見到中樞神經系統(tǒng)NPY 免疫陽性神經元數量的明顯減少［7］。NSCs治療AD 的目的主要通過兩種途徑：①內源性途徑，即誘導內源性NSCs增殖與分化，使受損傷的中樞神經系統(tǒng)進行自我修復；②外源性途徑，即直接替代缺損組織或植入基因工程細胞，這一類細胞能分泌促進干細胞增殖與存活的因子［8］。NSCS移植治療改善大鼠的空間學習記憶能力的機制目前還不完全清楚，可能的機制有：①移植的NSCs使基底前腦膽堿能神經元數目明顯增加，代替潰變的膽堿能神經元，同時提高了中樞膽堿能系統(tǒng)的活性，改善隔區(qū)、海馬等記憶中樞的功能。②移植的NSCs通過與宿主細胞的相互作用使腦內核酸和蛋白質的合成增加，提高了大腦的興奮狀態(tài)。③移植的細胞在體內分泌一些細胞因子和神經營養(yǎng)物質，從而促進神經元的存活和神經纖維的再生，形成側支發(fā)芽，提高膽堿能纖維的數量。④證據表明，無論是在發(fā)育、成熟還是在衰老過程中，突觸都處于不斷的退化和重建的動態(tài)過程之中，NSCs通過誘導宿主腦突觸的可塑性使退變的組織細胞產生新的突觸。

現代研究認為，針刺主要通過以下四個方面達到延緩衰老目的：一是提高機體免疫功能；二是可改善腦的氧代謝和血流量；三是可調整神經生化代謝的紊亂；四是可減少自由基的產生。中醫(yī)文獻中無“老年性癡呆”的病名，根據其臨床表現認為本病屬中醫(yī)“呆病”、“健忘”、“癲證”等范疇。其病因病機為肝腎虧虛、氣滯血瘀，以腎氣虛衰、髓?？仗?、腦神失養(yǎng)為其根本。臨床研究表明針灸治療AD 療效顯著。針刺治療AD 的原則是補腎活血、醒神開竅。補腎活血以治其本，醒神開竅以治其標。標本同治，盡早緩解癥狀，提高患者生存質量。

在上述治療原則的指導下，本實驗選取百會、大椎、人中三穴。百會穴為督脈和足太陽膀胱經的交會穴，具醒神開竅之功，為治療老年性癡呆的主要穴位，經臨床證實對于本病可能出現的精神、神志異常均有一定的療效。大椎出自《素問·氣府》，屬督脈經穴位，是手足六陽經的交會穴，為“諸陽之會”，可通調諸經，增強各臟腑經絡之功效，促使陰陽平衡。人中位于鼻下嘴上，鼻通天氣，嘴通地氣，該穴位于天地之間，正是“諸陽之?！钡亩矫}與“諸陰之海”的任脈交會點，具有調合陰陽之功，能滌蕩蒙蔽、醒腦開竅、疏經通絡的作用。取此三穴，可通督調神、調合陰陽，有暢行血脈、行氣化痰、活血生精、藏精生髓之功。AD 最早最重要的癥狀之一即近期記憶障礙，基于此，本實驗采用大鼠跳臺實驗，以驗證其學習記憶功能。跳臺實驗是一次性回避反應實驗，操作簡單，能夠比較客觀地反映動物經過一次刺激后記憶的獲得能力。實驗表明針刺能夠減少AD 大鼠的跳臺反應期，改善學習記憶。結合AD 病變中海馬NPY免疫反應陽性神經元顯著減少，本實驗以免疫組化方法定量測定了NPY 的表達。結果顯示，移植針刺組大鼠海馬NPY 表達比模型組增加（P＜0.01），同時與移植組比較有顯著性差異，說明針刺結合干細胞移植比單純干細胞移植效果更好。

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