電針耳穴對D－半乳糖致年齡相關性聽力損失豚鼠聽覺中樞丙二醛表達的影響△

謝仕津 殷澤登 李君梅 賴丹 歐小毅 黎萬榮

隨著老齡化社會的到來，年齡相關性疾病受到越來越廣泛的關注。在老年人中，年齡相關性聽力損失（age－related hearing loss，AHL）是僅次于關節炎和高血壓的常見慢性疾?。?］。AHL 嚴重影響老年人的生活質量，探索AHL 發病機制和防治措施尤為重要。研究顯示，針刺耳穴可有效治療突發性聾等感音神經性聾［2，3］，但利用針刺耳穴來防治老年性聾及其機制方面的研究較少。因此，本研究通過建立D－半乳糖致年齡相關性聽力損失豚鼠模型，觀察電針對其聽功能以及聽皮層、下丘和耳蝸核組織中丙二醛表達的影響，以探討丙二醛在AHL發病中的作用、電針對AHL的防治作用及機制，為電針防治AHL提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取耳廓反射靈敏、無噪聲暴露及耳毒性藥物使用史的4月齡豚鼠30只（體重300～550g），飼養適應一周后，隨機分為對照組、D－半乳糖模型組、D－半乳糖＋電針組，每組10只。2年齡豚鼠10只（體重600～900g）為老年組，由瀘州醫學院實驗動物中心提供。

D－半乳糖模型組于豚鼠頸背部皮下注射D－半乳糖［4～6］（C6H1206，AID SCIENCE，中國）300 mg·kg－1·d－1（40mg／ml），每日1次，連續6周。D－半乳糖＋電針組D－半乳糖的用法及用量同模型組，同時予以電針刺聽宮、翳風兩個穴位。對照組給予等量生理鹽水頸背部皮下注射，每天1次，連續6周。2年齡組不做任何處理，常規飼養。在飼養過程中，仔細觀察各組動物的外觀及表現。

1.2 實驗方法

1.2.1 電針 動物清醒狀態下，用自制裝置固定，取雙側聽宮、翳風穴［7］，用HM6805－I型經穴治療儀（HM6805－I型，1100801072，四川恒明科技開發有限公司）刺激，疏密波，頻率14Hz，強度0.4～0.6 mA，連續輸出，9 次／秒，持續刺激15 min，每天一次，連續針刺6周。

1.2.2 ABR 波Ⅲ潛伏期檢測 于實驗結束后對各組豚鼠行ABR 檢測，采用華中科技大學附屬協和醫院耳鼻咽喉聽力室建立的方法進行［8］。動物用10%水合氯醛350mg／kg行腹腔注射麻醉，用腦干誘發電位儀（Intelligent Hearing Systems，美國智聽公司）測試，刺激聲為短聲（click），觀察110dB SPL刺激強度下各組豚鼠波Ⅲ潛伏期的變化。

1.2.3 丙二醛含量的檢測 測試ABR 后，動物麻醉未醒前，斷頭、取雙側聽皮層、下丘、耳蝸核，立即用4 ℃生理鹽水洗凈血跡，放入－80 ℃冰箱中保存。硫代巴比妥酸法（TBA）法檢測丙二醛含量，操作步驟按丙二醛測試盒（20110110，南京建成生物工程研究所）說明進行。按下列公式計算樣品中丙二醛的含量：組織中丙二醛含量（nmol／mgprot）＝［（測定管OD 值一測定空白管OD 值）／（標準管OD值－標準空白管OD 值）］×標準品濃度（10nmol／ml）／蛋白含量（mgprot／ml）。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件，應用單因素方差分析對各組間結果差異進行比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 豚鼠外觀觀察 D－半乳糖模型組和老年組豚鼠毛色枯槁，無光澤，且頭頂部、背部、腹部掉毛嚴重；D－半乳糖模型組自造模4 周起，出現精神萎靡，倦怠嗜睡，進食減少，皮膚松弛，行動遲緩，自主活動減少。對照組外觀及表現如實驗前，D－半乳糖＋電針組外觀及表現介于D－半乳糖模型組和對照組之間。

2.2 各組豚鼠ABRⅢ波潛伏期的變化 刺激聲強度為110dB SPL 時，對照組、D－半乳糖模型組、D－半乳糖＋電針組和老年組ABR 波Ⅲ的潛伏期分別為0.89±0.88、1.06±0.14、0.90±0.10和1.00±0.10ms。與對照組比較，D－半乳糖模型組和老年組波Ⅲ潛伏期延長（P＜0.05）；與D－半乳糖模型組比較，D－半乳糖＋電針組波Ⅲ潛伏期縮短（P＜0.05）；D－半乳糖模型組與老年組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組豚鼠聽皮層、下丘、耳蝸核中丙二醛的表達情況 與對照組相比，D－半乳糖模型組和老年組豚鼠聽皮層、下丘、耳蝸核中丙二醛含量升高（P＜0.05）；與D－半乳糖模型組相比，D－半乳糖＋電針組三個部位丙二醛含量降低（P＜0.05）；D－半乳糖模型組與老年組相比，兩組之間丙二醛含量差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

3 討論

表1 各組豚鼠聽皮層丙二醛表達情況的比較（nmol／mgprot，±s）

表1 各組豚鼠聽皮層丙二醛表達情況的比較（nmol／mgprot，±s）

注：＊與對照組比較，P＜0.05；△與D－半乳糖模型組比較，P＜0.05

組別聽皮層下丘耳蝸核對照組1.17±0.34 0.81±0.22 2.27±0.56 D－半乳糖模型組 2.41±0.87＊1.61±0.70＊ 3.13±0.91＊D－半乳糖模型＋電針組1.45±0.88△0.98±0.20△ 2.16±0.73△老年組2.64±0.86＊1.74±0.62＊ 3.26±0.70＊

3.1 丙二醛在D－半乳糖致豚鼠年齡相關性聽力損失發病中的作用 近年來，自由基學說在AHL發生機制中的作用日益受到關注。隨著年齡的增加，機體抗氧化功能下降，氧自由基增多。氧自由基作用于脂質發生過氧化反應，可形成過氧化脂質，后者分解產生丙二醛。丙二醛能交聯蛋白質與核酸，影響細胞的基因表達和蛋白質的合成，還可導致線粒體膜損傷影響氧化磷酸化過程［9］，其含量的高低反映了細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度。氧自由基可引起耳蝸毛細胞內鈣超載而死亡，從而導致AHL的發生［10］。本研究中，老年組豚鼠聽皮層、下丘和耳蝸核中丙二醛的含量均明顯增加，說明丙二醛參與了老年性聾的發生，而本研究中D－半乳糖模型組各級聽覺中樞中丙二醛的表達也顯著增加，說明氧自由基增加所致的氧化損傷機制可能參與了D－半乳糖所致的豚鼠AHL，這與周媛等［11］的研究結果類似。丙二醛導致聽覺中樞老化的機制可能與耳蝸的自由基氧化損傷機制相似［12］，當然，這還需要進一步研究證實。

3.2 電針刺耳穴對D－半乳糖致豚鼠年齡相關性聾的干預作用及機制 衰老機制的自由基學說［13］認為：隨著年齡增長，抗氧化酶活性下降，自由基對機體損傷累積進而引起了衰老現象，在聽覺系統表現為聽力下降。因此，從抗氧化角度尋找能夠延緩、阻止疾病進程的治療方法是目前AHL 臨床研究的主要方向之一。研究表明，針刺可明顯降低D－半乳糖誘導的亞急性衰老小鼠和老年癡呆模型大鼠腦組織中丙二醛的含量，減少脂質過氧化反應和丙二醛生成，減少神經元的損傷，從而起到保護腦細胞、延緩衰老的作用［14，15］。本實驗結果顯示，與D－半乳糖模型組相比，D－半乳糖模型＋電針組豚鼠ABR 波Ⅲ潛伏期縮短，聽皮層、下丘和耳蝸核中丙二醛含量顯著降低，說明電針治療可以降低聽覺中樞中丙二醛的產生，減少聽覺中樞神經元的氧化損傷，從而延緩AHL的發生，但具體的信號轉導機制還需進一步研究。

研究表明，經絡的循行與神經、血管、淋巴管的循行分布基本一致，與人體應激系統也有密切關系［16］。針刺穴位作用于人體經絡，能夠促進血液運行，改善人體的新陳代謝，研究還發現，電針可加快耳部的血液循環、改善血液流變學的指標，為耳神經功能的恢復提供了物質基礎，使聽力得以恢復［17］。本研究根據針灸的“治未病”思想［18］，以針刺耳周腧穴防治老年性聾。聽宮為手太陽小腸經之穴，其經脈入耳中，翳風為手少陽三焦經之穴，其經脈沿耳后入耳中，出耳前；根據現代解剖學，聽宮穴有顳淺動脈的耳前支，有耳顳神經分布，深部有顳淺動脈出發處，翳風穴下布有耳大神經、耳顳神經、頸外動脈、靜脈及迷走神經等［19］，故針刺聽宮、翳風穴，可激發經氣，疏通耳部經絡，增強耳脈氣血的運行，平衡陰陽，調整內耳功能。另外，針刺能提高聽神經以及外側丘系橋腦的興奮性和傳導性、增強皮層對聲音感受的代償能力，從而改善聽功能［20］。本實驗結果顯示，針刺聽宮、翳風二穴可明顯改善豚鼠的聽功能，表明針刺聽宮、翳風穴位，可能通過增加耳蝸和聽覺中樞的血流量、改善聽覺中樞神經元的新陳代謝、提高蝸神經和各級聽覺中樞的興奮性和傳導性，提高皮層對聲音信息的利用，從而延緩年齡相關性聽力損失的發生。但其具體信號轉導機制還需進一步研究。

1 Wingfield A，Panizzon M，Grant MD，et al.A twin－study of genetic contributions to hearing acuity in late middle age［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2007，62：1 294.

2 宿健，于學平.針刺治療感音神經性耳聾［J］.針灸臨床雜志，2010，26：40.

3 吳迪，高維濱.電項針及耳周腧穴針刺治療突發性感音神經性耳聾［J］.針灸臨床雜志，2010，26：30.

4 崔美芝，劉浩，李春艷.衰老動物模型的建立及評價［J］.中國比較醫學雜志，2006，16：118.

5 朱亞珍，朱虹光.D－半乳糖致衰老動物模型的建立及其檢測方法［J］.復旦學報醫學版，2007，34：617.

6 曹湘博，于樂洋，常雅萍.D－半乳糖亞急性中毒擬衰老模型鼠免疫功能及生化指標變化的研究［J］.中國比較醫學雜志，2007，17：382.

7 張毅，董連勇.針刺對豚鼠鏈霉素致內耳損傷后期耳廓反射閾值，ATPase，ACT 活性的影響［J］.甘肅中醫，1995，8：39.

8 Kong WJ，Yin ZD，Fan GR，et al.Time course of neuronal and synaptic plasticity in dorsal cochlear nucleus of guinea pig following chronic kanamycin－induced deafness［J］.Brain Research，2010，1 328：118.

9 Lefebvre PP，Malgrange B，Lallemend F，et a1.Mechanisms of cell death in the injured auditory system：otoprotective strategies［J］.Audiol Neurootol，2002，7：165.

10 Riva C，Longuet M，Lucciano M，et a1.Implication of mitochondrial apoptosis in neural degeneration of cochlea in a murine model for presbycusis［J］.Rev Laryngol Otol Rhinol（Bord），2005，126：67.

11 周媛，謝鼎華，彭斌.年齡相關性聽力損失大鼠、聽皮層、蝸核、耳蝸SOD、MDA 變化及神經細胞凋亡初步觀察［J］.聽力學及言語疾病雜志，2009，17：58.

12 Seidman MD，Khan MJ，Bai U，et al.Biologic activity of mitochondrial metabolites on aging and age－related hearing loss［J］.Am J Otol，2000，21：161.

13 田文鳳，李強，劉毅.針刺抗衰老機制研究進展［J］.山東中醫藥大學學報，2004，28：319.

14 關晨霞，高希言，梁杰.針灸對亞急性衰老小鼠腦組織中一氧化氮、丙二醛、超氧化物歧化酶的影響［J］.針刺研究，2001，26：111.

15 李東紅，段燦燦，郝石磊，等.針刺合谷，、太沖對老年癡呆模型大鼠行為學及氧自由基的影響［J］.北京中醫藥，2010，29：311.

16 黃炳山.經絡結構應是應激系統的主要組成部分［J］.針灸臨床雜志，2004，20：4.

17 羅仁瀚，周杰，黃云聲，等.電針治療突發性耳聾療效對照觀察［J］.中國針灸，2009，29：185.

18 王華，梁鳳霞.“雙固一通”針灸法與疾病防治［J］.湖北中醫雜志，2004，26：3.

19 王永華，劉金洪，王楓，等.針刺及川芎嗪對慶大霉素致耳聾豚鼠螺旋神經節細胞凋亡及調控基因Bcl－2，Bax表達的影響［J］.中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志，2007，15：321.

20 張曉彤，袁國蓮，許珉，等.針刺“內聽宮”穴對突發性耳聾患者聽覺腦干誘發電位的影響［J］.中國針灸，2003，23：171.