SLP－2 在胃癌組織中的表達及其預后意義*

顏淑梅， 吳秋良△， 奚少彥， 梁建中， 張 玉， 馮沿芬，侯景輝， 盧佳斌， 黃春雨， 杜紫明， 周志偉

(1華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心2病理科，3胃胰科，廣東 廣州510060)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢。盡管胃癌在以手術為主的綜合治療方面取得了許多進展，但是5 年生存率仍然徘徊在30%～40 %左右，此現狀促使學者們對胃癌的發病機理及預后做多方面、多層次的研究。紅細胞膜整合蛋白SLP-2(stomatin -like protein 2)是stomatin 家族的新成員之一［1］，SLP-2 或其它整合蛋白與周邊組織細胞骨架聯合起來，參與了離子通道轉導、鞘脂類的組織以及膽固醇豐富的脂質筏的調控，影響細胞的黏附功能，從而成為腫瘤細胞侵襲轉移的重要因素之一。近年來發現SLP -2 作為一種細胞膜與線粒體內膜相關蛋白，可能參與了對細胞凋亡和細胞周期的調控，也可能在癌細胞侵襲、轉移等方面具有重要作用［2］。Zhang 等［3］首次發現SLP -2基因在食管鱗狀細胞癌中過表達，并與腫瘤的發生﹑發展關系密切。Jinawath 等［4］采用cDNA 微陣列的方法，發現stomatin 基因在彌散型胃癌中表達上調。張劍等［5］最近發現SLP -2 在胃腺癌組織中呈高表達，并與胃腺癌的淋巴結轉移和TNM 分期相關，但未研究與預后的關系。本實驗采用免疫組化方法檢測了胃癌組織SLP-2 蛋白表達，探討其在病理分期、淋巴結轉移、侵襲程度、預后等臨床特征方面的意義。

本研究采用兔抗SLP-2 多克隆抗體，應用免疫組化兩步法，研究SLP -2 基因的表達產物即SLP -2 蛋白在胃癌組織內定位、分布及SLP -2 蛋白表達與胃癌臨床病理的關系，探討其在胃癌發生、發展、入侵和轉移中的重要作用，為胃癌的診斷、監測和治療提供重要理論依據。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

數據源于中山大學腫瘤防治中心數據庫，剔除伴嚴重基礎疾病的病例。選取2005 年4 月至2006年12 月胃癌手術切除標本190 例，男性130 例，女性60 例，年齡最大82 歲，最小20 歲，中位年齡58 歲。術前術后均未行化療和放療。按2010 年TNM 分期標準分期，其中I 期23 例，II 期42 例，III 期100 例，IV 期25 例。其中淋巴結轉移陽性者140 例，陰性者50 例。病理分化程度:高/中分化腺癌69 例，低分化腺癌(包括印戒細胞癌和黏液腺癌)121 例。所有病例都有完整的臨床資料及石蠟標本。所有活檢標本均用10%中性甲醇液固定，切片HE 染色，由臨床病理高年資醫生閱片作出病理診斷。

2 方法

10%甲醇固定標本，石蠟包埋，切成4 μm 厚切片。采用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SP)法(SP 試劑盒邁新公司產品)，石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后用微波檸檬酸鈉修復20 min，用過氧化物酶阻斷劑(A 試劑)阻斷內源性過氧化物酶的活性，正常動物血清(B 試劑)封閉非特異性抗體，滴加1∶200 兔抗人SLP-2 多克隆抗體(Proteintech Group Inc)，4 ℃過夜。次日滴加生物素標記的第Ⅱ抗體(C 試劑)、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶溶液(D 試劑)、新鮮配制的3，3 -二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、中性樹膠封固。已知陽性胃癌切片作為陽性對照，PBS 緩沖液代替Ⅰ抗作為陰性對照。

3 SLP2 蛋白免疫組化的評分標準

組織切片中顯示胞質為淡黃色或棕黃色者為陽性細胞標志，SLP-2 蛋白定位于細胞質，凡顯色強度與背景無差異者為陰性，而顯色強度高于背景的為陽性表達。按照Song 等［6］SLP -2 免疫反應計分標準，將SLP-2 的表達染色強度得分與陽性細胞比例得分相乘。其中強度評分標準:1 分為陰性，2 分為弱陽性，3 分為中等陽性，4 分為強陽性;而陽性細胞比例分為:0 分為無陽性細胞，1 分為≤10%的陽性細胞，2 分為11% ～50%的陽性細胞，3 分為51% ～75%的陽性細胞，4 分為＞75%的陽性細胞。由2 位病理醫生獨立閱片，取其平均值。SLP2 表達陽性的標準為得分＞8 分。

4 隨訪

本組采用書信或電郵、電話與門診復診隨訪。隨訪起點時間為行胃癌手術當天，隨訪至2011 年9月26 日(2 ～76.5 個月，中位隨訪40.5 個月)。隨訪終點為死亡日期。

5 統計學處理

應用SPSS 16.0 軟件，對SLP -2 蛋白的陽性率與臨床病理參數、預后之間的關系用χ2檢驗。累積生存率根據壽命表法計算，生存曲線用Kaplan -Meier 法分析，單因素生存分析用log -rank 檢驗，用Cox 回歸進行多因素分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 SLP－2 在胃癌組織中的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系

SLP-2 蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜中的表達情況見圖1。SLP 蛋白在胃癌組織細胞漿和細胞膜中呈棕褐色粗顆粒狀，正常黏膜陰性或者弱陽性。SLP-2 蛋白在胃癌組織中表達的陽性率為63.2%(120/190)。SLP-2 蛋白的陽性率與胃癌浸潤深度(P ＜0.01)、TNM 分期(P ＜0.01)及淋巴結轉移(P＜0.05)有關，而與性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤直徑及遠處轉移均無關，見表1。

2 胃癌預后影響因素的單因素和多因素分析

單因素分析結果顯示:不同TNM 分期(P ＜0.01)、淋巴結轉移(P ＜0.01)、遠處轉移(P ＜0.01)、腫瘤直徑(P ＜0.01)、分化程度(P ＜0.05)、癌組織浸潤深度(P ＜0.01)和SLP-2 表達情況患者生存期均有顯著差異。單因素分析中，將SLP-2 表達陰性患者的死亡風險比設定為1，SLP -2 陽性患者的死亡風險比為2.23(95%CI:1.29 ～3.85，P ＜0.01)。從單變量分析中找到顯著影響預后的各指標，經Cox 比例風險模型多因素分析顯示，僅有TNM分期和腫瘤直徑是顯著獨立的預后指標(P ＜0.05，P＜0.01)，見表2。

3 SLP－2 表達與術后生存率的關系(Kaplan－Meier 生存分析)

SLP-2 陰性表達者生存率曲線始終在其陽性表達者之上，隨時間延長，生存率下降緩慢。5 年累計生存率SLP-2 陰性表達明顯高于陽性表達(P ＜0.01)，見圖2。

表1 SLP－2 蛋白表達與臨床病理參數之間的關系Table 1. Relationship between expression of SLP-2 protein and clinicopathological characteristics

表2 影響190 例胃癌患者預后的臨床病理變量的單因素和多因素分析Table 2. Univariate and multivariate survival analysis of clinicopathological variables in 190 cases of gastric carcinoma patients

Figure 2. Kaplan - Meier survival curves of gastric cancer patients after gastrectomy. The survival rate of the patients in SLP - 2 - positive group was significantly lower than that of the patients in SLP -2 - negative group (log-rank test，P ＜0.01).圖2 術后胃癌患者的生存曲線

討 論

胃癌具有早期癥狀不明顯、復發率高、淋巴結轉移早等特點，胃癌的病死率一直居高不下。然而，目前雖然有許多分子證實參與了胃癌的多種惡性表型，比如HER -2、VEGF、EGFR 等，但其在判斷預后方面的價值一直存在著爭議。因此，尋找新的與胃癌發生發展以及患者生存時間有關的生物學指標有重要的臨床意義。

SLP-2 基因是2000 年首次發現并命名的一個新基因，其表達產物在當時被鑒定為細胞膜相關蛋白［1］。SLP-2 是stomatin 基因超家族的一員，定位于染色體9p13.1［7］，其編碼的SLP-2 蛋白在人體組織中分布廣泛，其中在骨骼肌和心臟中的表達水平較高。有研究推測，該蛋白也出現在成熟紅細胞膜中，并且與血影蛋白-肌動蛋白細胞骨架相結合，或與其它整合膜蛋白結合，但其本身并不整合到膜脂質雙層結構中，可能作為外周膜蛋白起作用，從而將stomatin 或其它整合膜蛋白與細胞骨架聯系起來，調控離子通道的轉導、鞘脂和富含膽固醇的脂筏組織［7-8］。近年來關于線粒體的蛋白組學研究發現，SLP-2 存在于細胞的線粒體中［9］，并與一些線粒體內膜相關蛋白有直接結合，可能參與調節與其結合的線粒體膜相關蛋白的穩定性［2，10］。

SLP-2 在人的多種組織中如腦、肺、胸腺、氣管、食管黏膜、胃、心臟、結腸、小腸、腎臟、肌肉等中廣泛表達［11］。多項研究表明，SLP-2 在惡性腫瘤中表達明顯上調，在腫瘤的發生、發展過程中可能具有重要作用。Zhang 等［3］首次發現SLP-2 在食管鱗癌組織中表達上調，表達水平是正常食管黏膜的6 倍以上，其反義核酸可抑制腫瘤細胞的生長和增殖，使裸鼠致瘤能力大大降低。Cao 等［12-13］發現SLP -2 在喉鱗癌、乳腺癌中高表達，與預后相關。此后的一些研究表明，SLP - 2 在肺癌、子宮內膜癌、結直腸癌［6，12，14-18］等惡性腫瘤中也存在高表達。推測其在惡性腫瘤中的高表達是一個較為普遍的現象，SLP-2 可能是一個新的癌基因. 但目前關于SLP -2 基因的研究較少，其分子機制相關的研究更少。Song等［6］通過基因敲除技術，發現經SLP -2 基因敲除的神經膠質瘤細胞的侵襲、轉移能力下降，其分子機制可能是抑制了NF - κB/MMP -9 轉導通路。張劍等［5］最近發現SLP-2 在胃腺癌組織中呈高表達，并與胃腺癌的淋巴結轉移和TNM 分期相關。

本實驗采用免疫組織化學法檢測190 例胃腺癌組織中SLP-2 蛋白表達水平，結果顯示，SLP-2 蛋白陽性率為63.2%(120/190)。結合免疫組織化學結果和患者臨床病理資料進行分析發現，SLP -2 蛋白的高表達與胃癌浸潤深度、TNM 分期及淋巴結轉移有關(P ＜0.05)，即較晚期病例的胃腺癌組織SLP-2 蛋白的表達水平高于較早期病例的胃腺癌組織，有淋巴結轉移的病例相對應的胃腺癌組織中SLP-2蛋白的表達水平高于無淋巴結轉移的病例，癌組織浸潤超出肌層的病例相對應的胃腺癌組織中SLP-2蛋白的表達水平高于癌組織浸潤局限于肌層內的病例;而SLP-2 蛋白的表達與其它臨床病理參數沒有顯著相關性。提示SLP -2 可能是一個與胃腺癌分期和轉移相關的指標，在胃腺癌的發展、浸潤及轉移中起一定的促進作用。臨床資料進一步顯示:SLP -2 陽性表達患者5 年生存率明顯低于其陰性表達者，Kaplan-Meier 顯示SLP-2 陰性表達者5 年累積生存率高于陽性表達者，說明SLP-2 在一定程度上促進腫瘤的生長，其表達提示胃癌預后相對較差。

本研究發現SLP-2 在胃腺癌組織中呈高表達，并與胃腺癌的胃癌浸潤深度、TNM 分期及淋巴結轉移相關。從Cox 比例風險模型單、多因素分析可見:只有腫瘤直徑和TNM 分期是顯著獨立的預后指標，SLP-2 雖不是獨立的預后因素，但它與影響胃癌預后因素存在相互關聯，其過度表達在一定程度上能影響胃癌的預后。這提示SLP -2 表達不僅參與了胃癌的發生，而且與腫瘤的進展、轉移有關;其基因產物陽性表達的胃癌患者更易發生淋巴結轉移。然而SLP-2 參與惡性腫瘤發生發展的作用機制尚不清楚。Christie 等［19］研究發現，SLP -2 可能通過調節線粒體膜磷脂濃度，使得線粒體膜離子通道復合物順利組裝合成，包括復合物I、II，從而增加細胞的ATP 儲備。通過Song 等［6］的研究結果，我們可以推測SLP-2 可能通過影響MMP -9 蛋白的表達來干擾NF-κB/MMP -9 轉導通路，從而影響腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。因此，SLP-2 可能作為胃癌的一個有意義的預后指標，指導胃癌患者的預后生存，并有可能作為一個新的腫瘤靶向治療的靶點，但對其具體功能及機制，有待我們更深入地研究。

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