地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉促進(jìn)胃癌MGC－803 細(xì)胞凋亡和G0 /G1 期阻滯的機(jī)制研究*

張國強(qiáng)， 彭敏霞， 王曄愷， 周吉航， 曾 芳

(舟山醫(yī)院1肝膽外科，2超聲科，3檢驗(yàn)科，4細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，舟山 浙江316004)

轉(zhuǎn)移抑制基因23 - H1(non - metastasis 23 -H1，nm23 -H1)參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。在多種腫瘤中如結(jié)腸癌［1］、前列腺癌［2］、非小細(xì)胞肺癌［3］中，抑癌基因nm23 -H1 的低表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后高度相關(guān)，并且體外胃癌細(xì)胞株從低侵襲性的懸浮態(tài)向高侵襲性的黏附態(tài)轉(zhuǎn)化中也出現(xiàn)胞內(nèi)nm23 -H1 的表達(dá)降低［4］。地西他濱(decitabine，DCA)和丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是2 種不同機(jī)制的表觀遺傳學(xué)藥物，在多種腫瘤細(xì)胞中可聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯［5］。我們通過2 種藥聯(lián)用觀察其對(duì)胃癌MGC -803 抑癌基因nm23 -H1表達(dá)的影響，探討其對(duì)細(xì)胞凋亡、周期影響的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑和儀器

地西他濱(5 - 氮雜-2' - 脫氧胞嘧啶核苷粉劑)購自Sigma，注射用丙戊酸鈉(德巴金針)購自賽諾菲-安萬特公司，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-碘化丙啶(Annexin V/PI)凋亡試劑盒、細(xì)胞周期分析試劑盒購自BD，DNA 提取純化試劑盒購自Promega，Trizol購自Invitrogen，One Step SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa，小牛血清和RPMI -1640 培養(yǎng)液購自碧云天生物技術(shù)研究所。nm23 -H1 上游引物5’-TGGTGAAGACGGGCCGAGTCA -3’，下游引物5’-ATCAGATGGTCGGGGATGGTAACAC-3’，產(chǎn)物長度382 bp。GAPDH 上游引物5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，下游引物5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA - 3’，產(chǎn) 物 長 度102bp。熒光PCR 儀為ABI 7500，CO2培養(yǎng)箱為德國Jouan IG150 產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為BD FACSCalibur 產(chǎn)品，獲取軟件為CellQuest，細(xì)胞周期分析軟件為Flowjo，冰凍離心機(jī)為Eppendorf 5714R。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 胃癌細(xì)胞株MGC -803購自中科院上海細(xì)胞庫。用含10%小牛血清、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI -1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞備用。配制密度為1 ×108/L 的細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml，置37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按照分組分別加入終濃度為DCA 1.5 μmol·L-1、DCA 3.0 μmol·L-1、VPA 1.5 mmol·L-1、DCA 1.5 μmol·L-1+VPA 1.5 mmol·L-1和DCA 3.0 μmol·L-1+VPA 1.5 mmol·L-1，每組設(shè)6復(fù)孔，作用72 h 后各孔吸出培養(yǎng)液，PBS 洗1 次，吸棄PBS 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 Annexin V/PI 標(biāo)記法觀察細(xì)胞凋亡 2.1 步驟中細(xì)胞用預(yù)冷PBS 洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管加5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，避光靜置15 min，加300 μL 預(yù)冷的PBS，振蕩混勻上機(jī)檢測其早、晚期凋亡率。

2.3 細(xì)胞周期分析 2.1 步驟中細(xì)胞用預(yù)冷PBS 洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管依次加A、B、C 液，避光靜置15 min，加300 μL 預(yù)冷的PBS，振蕩混勻上機(jī)檢測，用Flowjo 軟件中的Watson(Pragmatic)模型分析細(xì)胞周期各期比例。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測nm23 -H1 mRNA 表達(dá) Trizol 提取總RNA，A260/280鑒定完整性和純度，反應(yīng)體系20 μL:包括總RNA 2 μL，PCR 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，Primer Script One Step Enzyme Mix Ⅱ0. 8 μL，One Step SYBR RT-PCR Buffer 10 μL，加ddH2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件:42 ℃5 min，95 ℃10 s，95 ℃5 s，55 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法分析nm23 -H1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Annexin V/PI 法檢測細(xì)胞凋亡

所有加藥組早期凋亡率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);VPA 1.5 mmol·L-1+DCA 1.5 μmol·L-1聯(lián)合用藥組高于DCA 1.5 μmol·L-1組和VPA 1.5 mmol·L-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);VPA 1.5 mmol·L-1+DCA 3.0 μmol·L-1聯(lián)合用藥組高于DCA 3.0 μmol·L-1組和VPA 1.5 mmol·L-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖1、表1。

Figure 1. Synergistic effect of DCA and VPA on MGC-803 cell apoptosis detected by Annexin V/PI staining. A:normal control;B:DCA 1.5 μmol·L-1;C:DCA 3.0 μmol·L-1;D:VPA 1.5 mmol·L-1;E:VPA 1.5 mmol·L-1 +DCA 1.5 μmol·L-1;F:VPA 1.5 mmol·L-1 +DCA 3.0 μmol·L-1.圖1 Annexin V /PI 染色檢測地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞凋亡的影響

表1 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞凋亡的影響Table 1. Synergistic effect of DCA and VPA on MGC-803 cell apoptosis (%. ±s.n=6)

表1 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞凋亡的影響Table 1. Synergistic effect of DCA and VPA on MGC-803 cell apoptosis (%. ±s.n=6)

＊＊ P ＜0.01 vs normal control group;▲▲P ＜0.01 vs corresponding concentration of single drug group.

Group Early stage Late stage Normal control 2.91 ±0.39 5.31 ±0.36 DCA 1.5 μmol·L -1 10.63 ±1.86＊＊ 10.93 ±1.32＊＊DCA 3.0 μmol·L -1 27.33 ±2.19＊＊ 32.84 ±3.22＊＊VPA 1.5 mmol·L -1 7.33 ±1.15＊＊ 5.23 ±1.36＊＊VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 1.5 μmol·L -1 33.58 ±3.88＊＊▲▲ 31.52 ±4.20＊＊▲▲VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 3.0 μmol·L -1 42.61 ±4.23＊＊▲▲ 38.01 ±3.86＊＊▲▲

2 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

SubG1期:VPA 1.5 mmol·L-1+DCA 1.5 μmol·L-1聯(lián)合用藥組(15.39% ±0.73%)和VPA 1.5 mmol·L-1+ DCA 3.0 μmol·L-1聯(lián) 合 用 藥 組(18.79% ±1.26%)均高于各自的單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);G0/G1期:VPA 1.5 mmol·L-1+ DCA 1.5 μmol·L-1聯(lián) 合用 藥 組(61.55% ±2.38%)和VPA 1.5 mmol·L-1+DCA 3.0 μmol·L-1聯(lián)合用藥組(66.75% ±2.48%)均高于各自的單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);S 期:VPA 1.5 mmol·L-1+ DCA 1.5 μmol·L-1聯(lián) 合 用 藥 組(11.17% ±0.94%)和VPA 1.5 mmol·L-1+ DCA 3.0 μmol·L-1聯(lián)合用藥組(6.97% ±1.10%)均低于各自的單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);G2/M 期:VPA 1.5 mmol·L-1+DCA 1.5 mmol·L-1聯(lián)合用藥組(11.89% ± 3.08%)和VPA 1.5 mmol·L-1+ DCA 3.0 μmol·L-1聯(lián)合用藥組(8.50% ±2.81%)均低于各自的單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖2、表2。

3 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞中nm23－H1 mRNA 表達(dá)的影響

所有加藥組nm23 - H1 mRNA 均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);VPA 1.5 mmol·L-1+DCA 1.5 μmol·L-1聯(lián)合用藥組高于DCA 1.5 μmol·L-1組和VPA 1.5 mmol·L-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);VPA 1.5 mmol·L-1+DCA 3.0 μmol·L-1聯(lián)合用藥組高于DCA 3.0 μmol·L-1組和VPA 1.5 mmol·L-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見表3。

Figure 2. Synergistic effect of DCA and VPA on cell cycle of MGC-803 cells.A:normal control;B:DCA 1.5 μmol·L -1;C:DCA 3.0 μmol·L -1;D:VPA 1.5 mmol·L -1;E:VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 1.5 μmol·L -1;F:VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 3.0 μmol·L -1.圖2 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞周期的影響

表2 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞周期的影響Table 2. Synergistic effect of DCA and VPA on cell cycle of MGC-803 cells (%. ±s.n=6)

表2 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)MGC－803 細(xì)胞周期的影響Table 2. Synergistic effect of DCA and VPA on cell cycle of MGC-803 cells (%. ±s.n=6)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal control group;▲▲P ＜0.01 vs corresponding concentration of single drug group.

Group SubG1 G0/G1 S G2/M Normal control 2.49 ±0.75 50.77 ±1.78 19.76 ±1.04 26.98 ±1.59 DCA 1.5 μmol·L -1 7.39 ±0.59＊＊ 53.60 ±3.76 18.38 ±0.63 20.64 ±3.87*DCA 3.0 μmol·L -1 11.29 ±1.25＊＊ 57.64 ±2.81＊＊ 14.55 ±1.18＊＊ 16.52 ±2.83＊＊VPA 1.5 mmol·L -1 4.15 ±1.32＊＊ 51.28 ±1.79 19.52 ±0.61 25.05 ±2.53 VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 1.5 μmol·L -1 15.39 ±0.73＊＊▲▲ 61.55 ±2.38＊＊▲▲ 11.17 ±0.94＊＊▲▲ 11.89 ±3.08＊＊▲▲VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 3.0 μmol·L -1 18.78 ±1.26＊＊▲▲ 66.75 ±2.48＊＊▲▲ 6.97 ±1.10＊＊▲▲ 8.50 ±2.81＊＊▲▲

表3 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)HL－60 細(xì)胞中nm23－H1 mRNA 表達(dá)的影響Table 3. Synergistic effect of DCA and VPA on nm23 -H1 mRNA expression in MGC-803 cells (±s.n=6)

表3 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對(duì)HL－60 細(xì)胞中nm23－H1 mRNA 表達(dá)的影響Table 3. Synergistic effect of DCA and VPA on nm23 -H1 mRNA expression in MGC-803 cells (±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs normal control group;▲▲P ＜0.01 vs corresponding concentration of single drug group.

Group nm23-H1/GAPDH Normal control 0.43±0.12 DCA 1.5 μmol·L -1 0.96±0.21＊＊DCA 3.0 μmol·L -1 1.31±0.20＊＊VPA 1.5 mmol·L -1 0.69±0.09＊＊VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 1.5 μmol·L -1 1.84±0.46＊＊▲▲VPA 1.5 mmol·L -1 +DCA 3.0 μmol·L -1 2.88±0.42＊＊▲▲

討 論

nm23 -H1 可通過多信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞活性、生長、分化，目前的研究顯示B 細(xì)胞中nm23 -H1 通過上調(diào)凋亡蛋白如caspase -3、caspase -9、Bcl -X 及P53、P21 表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡，以及通過下調(diào)cyclin D1 表達(dá)水平引起細(xì)胞G0/G1期阻滯［6］。本研究顯示，DCA 和VPA 2 種藥物能促進(jìn)細(xì)胞凋亡和G0/G1期阻滯，并且和DCA 呈一定的劑量依賴性。DCA和VPA 除了直接作用于細(xì)胞活性以外，兩藥聯(lián)用還能間接增強(qiáng)部分腫瘤細(xì)胞的對(duì)外部處理因素的敏感性，如Lee 等［7］觀察到兩藥聯(lián)用能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。本研究顯示，2 種藥物能共同作用于促胃癌細(xì)胞MGC -803 細(xì)胞凋亡，并且早期/中晚期凋亡率均呈DCA 劑量依賴性，其中可能和共同促抑癌基因nm23 -H1 的表達(dá)有關(guān)。在體外，在腫瘤細(xì)胞中通過載體過表達(dá)nm23 -H1 也能顯示細(xì)胞多種活性受到抑制［8］。DCA 和VPA 雖都作用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，但DCA 主要通過抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，而VPA 主要通過抑制組蛋白去乙酰化，但對(duì)胃癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，高甲基化的、轉(zhuǎn)錄靜止的基因通過組蛋白去乙酰化酶抑制劑和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理后能再活化，但僅用組蛋白去乙酰化酶抑制劑則收效甚微。這一研究提示了DNA 甲基化在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中占主導(dǎo)地位，它可以通過不依賴于組蛋白去乙酰化的方式抑制基因的轉(zhuǎn)錄［9］。

目前臨床胃癌的一線化療方案的順鉑、表柔比星、氟尿嘧啶等藥物多為細(xì)胞周期特異性或非特異性藥物，通過干擾細(xì)胞分裂某一特定或多個(gè)時(shí)期實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制，對(duì)正常細(xì)胞帶有非特異性殺傷作用，副作用多。研究發(fā)現(xiàn)用表觀遺傳學(xué)藥物治療幾種類型的血液腫瘤，起效快，副作用小，優(yōu)于傳統(tǒng)的化療藥物，但在實(shí)體瘤如胃癌中療效卻不如血液腫瘤穩(wěn)定，我們認(rèn)為可能和血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的分散相有利于充分接觸藥物有關(guān)。雖然本研究中觀察到nm23 -H1 基因得到了激活，但由于表觀遺傳學(xué)藥物具有激活多種抑癌基因的效果，故我們不排除兩藥聯(lián)合作用于MGC -803 細(xì)胞凋亡中有其它抑癌基因的參與。

［1］ Pasz-Walczak G，Salagacka A，Potemski P，et al.Maspin and Nm23 - H1 expression in colorectal cancer［J］. Neoplasma，2010，57(2):95 -101.

［2］ Andolfo I，De Martino D，Liguori L，et al. Correlation of NM23 -H1 cytoplasmic expression with metastatic stage in human prostate cancer tissue［J］. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2011，384(4 -5):489 -498.

［3］ Liu C，Liu J，Wang X，et al. Prognostic impact of nm23-H1 and PCNA expression in pathologic stage I non -small cell lung cancer［J］. J Surg Oncol，2011，104(2):181 -186.

［4］ Iizuka N，Tangoku A，Hazama S，et al. Nm23 -H1 gene as a molecular switch between the free - floating and adherent states of gastric cancer cells［J］. Cancer Lett，2001，174(1):65 -71.

［5］ Hrebackova J，Hrabeta J，Eckschlager T.Valproic acid in the complex therapy of malignant tumors［J］. Curr Drug Targets，2010，11(3):361 -379.

［6］ Choudhuri T，Murakami M，Kaul R，et al. Nm23 -H1 can induce cell cycle arrest and apoptosis in B cells［J］.Cancer Biol Ther，2010，9(12):1065 -1078.

［7］ Lee JH，Lee KH，Lee JH，et al. Decreased incidence of febrile episodes with antibiotic prophylaxis in the treatment of decitabine for myelodysplastic syndrome［J］.Leuk Res，2011，35(4):499 -503.

［8］ Marino N，Marshall JC，Steeg PS. Protein-protein interactions:a mechanism regulating the anti-metastatic properties of Nm23 - H1［J］. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2011，384 (4 -5):351 -362.

［9］ Meng CF，Zhu XJ，Peng G，et al. Promoter histone H3 lysine 9 di -methylation is associated with DNA methylation and aberrant expression of p16 in gastric cancer cells［J］. Oncol Rep，2009，22(5):1221 -1227.