桑麻合劑提取純化工藝研究

邱建永 王洛臨 李智勇 張建軍 許曼嬌

1.廣東省第二中醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)研究所制劑研究室，廣東廣州 510095；3.廣東省第二中醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510095

桑麻合劑是廣東省第二醫(yī)院研制的醫(yī)院制劑，由桑白皮、紫菀、甘草等12味藥組成，具有清熱宣肺、化痰止咳的功效，主要用于風熱咳嗽癥狀。臨床上以湯劑煎服，療效確切。黃酮類成分為方中多味藥材的主要藥效成分之一[1-2]，因此，本研究選用總黃酮含量和干浸膏得量作為評價指標，采用正交設計法和單因素優(yōu)選法，分別優(yōu)選其提取工藝和純化工藝，以便更好地發(fā)揮該制劑的療效。

1 儀器與試藥

UV22501PC型可見分光光度計（島津），Bp211D電子分析天平（德國，sartorius）。蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200306）。桑麻合劑所用藥材均由廣東廣弘藥業(yè)有限公司購得，經(jīng)畢曉黎副主任中藥師鑒定為正品；所用化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取工藝優(yōu)選

2.1.1 正交試驗設計

根據(jù)預試驗結果，選擇影響提取因素的料液比、提取時間、提取次數(shù)，進行優(yōu)選，其因素水平設計見表1。

表1 因素水平表

2.1.2 供試品溶液的制備

按處方比例，稱取桑白皮、紫菀、甘草等12味藥材共9份，每份136.6 g，按正交試驗設計表L9（34）安排，分別提取，過濾，濾液分別濃縮并定容至200 mL。測定干浸膏含量和總黃酮含量。

2.1.3 干膏含量的測定

精密吸取各樣品濃縮液25 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照干燥失重測定法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅨG）測定，計算干膏得量。

2.1.4 總黃酮含量測定[4]

2.1.4.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱取6 mg蘆丁，精密稱定，加95%乙醇定容至50 mL，得0.12 mg/mL的蘆丁標準對照液。

2.1.4.2 測定波長的確定 精密移取蘆丁對照溶液10 mL置25 mL容量瓶中，振蕩搖勻后，加入5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻靜置6 min，再加4.3%氫氧化鈉10 mL，搖勻后，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻放置15 min，以95%乙醇調(diào)零，從400 nm至600 nm進行全波長掃描，測得503 nm處有最大吸收，因此，以503 nm為測定波長。

2.1.4.3 標準曲線的制備[4] 精密吸取上述對照品溶液2、4、6、8、10 mL至25 mL容量瓶，分別加蒸餾水稀釋至10 mL，振蕩搖勻后，自“加入5%亞硝酸鈉1 mL”起，同測定波長的確定法操作，以試劑作空白，于503 nm下測定吸光值，以吸光度值（A）為縱坐標，蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：C=0.078 5A-0.000 3（r=0.998 7）。結果表明蘆丁對照品在0.009 6～0.096 0 mg/mL呈線性關系。

2.1.4.4 供試品溶液的制備與測定 精密吸取提取液2 mL，加蒸餾水定容至50 mL，搖勻，精密吸取稀釋液1 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至10 mL，按上述方法操作顯色，計算總黃酮含量。

2.1.4.5 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液0.6mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作顯色，平行測定6次，結果RSD=0.27%，表明精密度良好。

2.1.4.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取上述供試品溶液0.6 mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作顯色，分別放置0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，測定各時間點的吸光度，結果RSD=1.79%，表明供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.7 重復性試驗 精密吸取供試品溶液各0.6 mL，置10 mL量瓶中，按上述方法操作顯色，測定吸光度，結果RSD=2.31%，表明重復性良好。

2.1.4.8 加樣回收率測定 精密稱取已知黃酮含量的供試品5份，分別加入蘆丁對照品適量，按上述方法操作顯色，測定吸光度，計算回收率為98.9%，RSD=0.91%。說明該方法測定結果準確。

2.1.5 數(shù)據(jù)處理與工藝優(yōu)選

用綜合加權評分法，以干浸膏得量和總黃酮含量的9次試驗的最大值為100分，將各指標成分的總量分別轉換為評分值，總固體得量的加權系數(shù)為0.4，總黃酮含量的加權系數(shù)為0.6，將每次試驗的各指標成分的評分值乘以相應的加權系數(shù)后求和，得綜合評分值，以綜合評分值計算正交試驗結果，并進行方差分析，結果見表2、3。

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析表

結果表明：由直觀分析可知因素主次為提取次數(shù)（C）＞液料比（A）＞提取時間（B）。方差分析表明，因素A和因素C對試驗結果有顯著影響，因素B對試驗結果無影響。因此，提取工藝條件定為：處方藥材加水提取3次，每次加8倍量水，提取1.0 h，即A2B1C3。

2.1.6 提取工藝驗證

按處方比例，稱取藥材3份，每份136.6 g，按正交試驗結果的最佳工藝條件重復試驗3次，結果表明：干浸膏得量分別 為：34.80、34.51、33.09 g，總 黃 酮 含 量 為2.254、2.268、2.205 g，平均綜合評分值為96.020。與正交試驗最大綜合評分值接近，提示優(yōu)選的工藝穩(wěn)定。

2.2 純化工藝優(yōu)選

2.2.1 藥液含醇量的確定

取按上述提取條件制備的浸膏（浸膏-藥材比為1∶1）3份，每份273.2，分別加乙醇至表4所示藥液含醇量，冷藏靜置24 h，取濾過，濾液回收乙醇，并定容至200 mL。分別照上述方法測定濾液固形物含量和總黃酮含量，剩余濾液回流煮沸30 min，冷藏放置24 h，觀察藥液澄明度，結果見表4。

表4 藥液含醇量對純化的影響

結果表明：純化藥液含醇量為70%，可滿足本品制成合劑的要求。

2.2.2 濃縮液相對密度的確定

取按上述提取條件制備的浸膏（浸膏-藥材比為1∶1）4份，每份273.2 g，分別濃縮并加水調(diào)整至表5所示濃縮比，混勻，用密度計測定60℃時濃縮液的相對密度，濃縮液分別加乙醇至藥液含醇量70%，冷藏24 h，濾過，濾液回收乙醇并定容至200 mL，測定各濃縮液中總黃酮含量，結果見表5。

表5 藥液濃縮比對純化的影響

結果表明：濃縮至相對密度為1.05～1.10（60℃）比較合理。

3 討論

由于部分黃酮類成分具有易溶于乙醇和熱水的特點，在含量測定過程中，濃縮液出現(xiàn)沉淀應充分搖勻后迅速取樣，否則易造成測定結果的偏差。

中藥復方藥效成分復雜，作用靶點尚不清晰，因此，本制劑選擇用水提取的工藝，更符合原湯劑合煎有效的特點。提取工藝篩選以總黃酮含量和干浸膏得量為評價指標進行綜合評分，鑒于總黃酮含量比干浸膏得量能更好地反映藥物提取情況，故在設計權重系數(shù)時，總黃酮含量權重系數(shù)較大，二者的權重系數(shù)設計為6∶4，這樣相對合理些。經(jīng)正交試驗驗證結果表明，優(yōu)選的提取工藝參數(shù)穩(wěn)定，可行。

本制劑純化工藝采用了傳統(tǒng)的乙醇沉淀工藝，試驗分別對藥液含醇量和濃縮液的相對密度兩個重要的影響因素進行篩選，經(jīng)穩(wěn)定性考察，優(yōu)選出的最佳醇沉工藝穩(wěn)定，可滿足本合劑對澄明度的要求。

[1]楊樂，陳泣.桑白皮研究進展[J].江西中醫(yī)學院學報，2007，19（3）：98-100.

[2]侯海燕，陳立，董俊興.紫菀化學成分及藥理活性研究進展[J].中國藥學雜志，2006，41（3）：161-163.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄Ⅵ30.

[4]劉齊林，李雪婷，王沛，等.正交設計優(yōu)選痛風寧的最佳提取工藝[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（5）：959-960.

[5]于村，俞莎，沈向紅.中草藥總黃酮的提取和含量測定[J].浙江預防醫(yī)學，2002，14（7）：81-82.