四逆散有效組分改善睡眠作用與5-羥色胺能神經系統相關性的實驗研究

張 喬 金 陽 徐瑞鑫 李廷利

1.黑龍江中醫藥大學藥學院中藥藥理教研室，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱 150525

四逆散出自于《傷寒論》少陰病篇，為仲景名方。組方柴胡、枳實、芍藥、甘草四味，臨床應用廣泛[1]。近年來有學者針對四逆散做了許多臨床和藥理學研究工作，根據本實驗室近期的研究來看，四逆散有非常明確的改善睡眠的作用[2]。為進一步闡明基于5-HT能神經系統的四逆散有效組分改善睡眠的作用機制，筆者現通過四逆散有效組分對腦內5-HT能神經系統的多種物質含量的影響，表明其相關性。

1 儀器與試藥

1.1 實驗動物

KM種小鼠，清潔級，雄性，體重（23±2）g，由黑龍江中醫藥大學GLP實驗室提供。

1.2 實驗藥物

四逆散有效組分的組成成分：辛弗林、芍藥苷、柴胡皂苷C、甘草次酸（均由成都思科華生物技術有限公司提供），四者比例關系為8∶1∶1∶5，臨用前用含2%吐溫-80的生理鹽水配制成66.00 mg/mL濃度溶液，現用現配。

1.3 主要實驗試劑

5-羥色氨酸：（Aladdin，批號：30817）；對氯苯丙氨酸：（Sigma，批號：C6506）。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 閾下劑量5-HTP聯合閾下劑量四逆散有效組分對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 取KM種小鼠60只，隨機分成4組，分別為空白組、四逆散有效組分組、5-HTP組以及四逆散有效組分+5-HTP組（即為聯合組），每組15只，連續給藥4 d，給藥途徑均為腹腔注射。四逆散有效組分組和聯合組分別給予四逆散混合有效組分溶液（16.50 mg/mL，165.00 mg/kg，腹腔注射）；空白組和5-HTP組給予等體積生理鹽水，5-HTP組和聯合組均在注射戊巴比妥鈉前15 min給予5-HTP（2.5 mg/mL，25 mg/kg，腹腔注射），各組末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg，分別記錄各組小鼠入睡的潛伏期及睡眠持續時間。

2.1.2 四逆散有效組分聯合PCPA對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 取KM種小鼠60只，隨機分成4組，分別為空白組、四逆散有效組分組、PCPA組以及四逆散有效組分+PCPA組（即為聯合組），每組15只，連續給藥4 d，給藥途徑均為腹腔注射。四逆散有效組分組和聯合組分別給予四逆散混合有效組分溶液（66.00 mg/mL，660.00 mg/kg，腹腔注射）；空白組和PCPA組給予等體積生理鹽水，PCPA組和聯合組均在注射戊巴比妥鈉前24 h行皮下注射PCPA（30 mg/mL，300 mg/kg，皮下注射），所有各組末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg，分別記錄各組小鼠入睡的潛伏期及睡眠持續時間。

2.1.3 四逆散有效組分對小鼠前額葉皮質、海馬和下丘腦等不同腦區5-HT和5-HIAA含量的影響 取KM種小鼠30只，隨機分成2組，即空白組和四逆散有效組分組，每組15只，四逆散有效組分組分別給予四逆散混合有效組分（66.00 mg/mL，660.00 mg/kg，腹腔注射），空白組注射等體積生理鹽水，連續給藥4 d，末次給藥后30 min，斷頭取腦，低溫分離前額葉皮質、海馬和下丘腦，分析天平稱重，加入9倍生理鹽水勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，酶聯免疫吸附（Elisa）法測定其中5-HT和5-HIAA的濃度。

2.2 統計學方法

實驗數據采用SPSS 13.0軟件包處理，計量資料數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析（Oneway-ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2.3 結果

2.3.1 閾下劑量四逆散有效組分聯合5-HTP對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 閾下劑量四逆散有效組分聯合5-HTP對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響結果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組以及5-HTP組小鼠無論從睡眠潛伏期均有縮短的趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）；在睡眠持續時間上均有延長的趨勢，但統計學上無顯著變化（P>0.05）。但是，當閾下劑量四逆散和5-HTP聯合應用時，與空白組比較，小鼠的睡眠潛伏期明顯縮短（P<0.05），睡眠持續時間顯著延長（P<0.05）。見表1。

表1 四逆散有效組分聯合閾下劑量5-羥色氨酸（5-HTP）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

表1 四逆散有效組分聯合閾下劑量5-羥色氨酸（5-HTP）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05

組別 樣本數 潛伏期（s）睡眠持續時間（min）空白組四逆散有效組分組5-HTP組四逆散有效組分+5-HTP 15 15 15 15 228.9±93.7 215.4±68.1 173.0±36.9 130.6±48.2*44.5±20.8 60.2±30.1 50.3±15.0 84.9±20.5*

2.3.2 四逆散有效組分聯合PCPA對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 睡眠潛伏期的實驗結果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組小鼠睡眠的潛伏期明顯縮短（P<0.05）。睡眠持續時間的實驗結果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組可以顯著延長小鼠睡眠時間（P<0.05），而PCPA組的睡眠持續時間明顯縮短（P<0.05）。另聯合組與空白組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 四逆散有效組分聯合對氯苯丙氨酸（PCPA）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

表2 四逆散有效組分聯合對氯苯丙氨酸（PCPA）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與四逆散有效組分組比較，#P<0.05

組別 樣本數 潛伏期（s）睡眠持續時間（min）空白組四逆散有效組分組PCPA組四逆散有效組分+PCPA 15 15 15 15 293.2±127.6 192.1±48.9*211.7±45.5 272.3±83.9 58.5±12.1 79.3±24.5*37.8±9.8*62.3±18.8#

2.3.3 四逆散有效組分對小鼠不同腦區5-HT以及5-HIAA含量的影響 實驗結果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組小鼠前額葉皮質區5-HT的濃度明顯升高（P<0.05），而海馬區和下丘腦部位的5-HT濃度則無明顯變化（P>0.05）。與空白組比較，，四逆散有效組分組小鼠前額葉皮質腦區的5-HIAA濃度顯著降低（P<0.05），海馬部位和下丘腦區5-HIAA濃度的雖然都有下降的趨勢，但是差異無統計學意義（P>0.05）。見表3、4。

表3 四逆散有效組分對小鼠不同腦區5-羥色胺（5-HT）濃度的影響（±s，ng/g）

表3 四逆散有效組分對小鼠不同腦區5-羥色胺（5-HT）濃度的影響（±s，ng/g）

注：與空白組比較，*P<0.05

組別 樣本數5-HT前額葉皮質 海馬 下丘腦空白組四逆散有效成分組15 15 1 019.1±431.8 1 435.7±458.3*990.5±395.8 1 005.7±289.0 1 198.4±639.0 1 068.2±336.6

表4 四逆散有效組分對小鼠不同腦區5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）濃度的影響（±s，ng/g）

表4 四逆散有效組分對小鼠不同腦區5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）濃度的影響（±s，ng/g）

注：與空白組比較，*P<0.05

5-HIAA前額葉皮質 海馬 下丘腦空白組四逆散有效組分組15 15 167.26±31.11 140.86±19.87*164.90±23.92 158.15±32.61 166.61±31.13 150.29±36.39

3 討論

中樞5-HT能神經系統作為直接或間接參與睡眠生理調節的主要神經遞質之一，在睡眠和覺醒調節方面起重要作用[3]。腦內5-HT主要來自中縫核上部，其前體物質是色氨酸，經色氨酸羥化酶的作用形成5-HTP（5-羥色氨酸），后者在5-羥色胺酸脫羧酶的作用下生成5-HT。因此，破壞5-HT能神經末梢或抑制色胺酸羥化酶的作用，會阻斷腦內5-HT的合成，外在表現失眠狀態。若在此期間注射5-HT的前體物質5-HTP（5-羥色氨酸），則失眠可恢復至正常。

本實驗結果顯示閾下劑量的5-HTP和四逆散有效組分分別應用存在作用趨勢，無顯著性差異，但二者聯合應用時，產生協同作用，可明顯延長戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠時間，由此可見，四逆散有效組分對小鼠睡眠的影響與增加腦內5-HT前體物質5-HTP的含量有關。

PCPA是小鼠腦內5-HT合成酶——色氨酸羥化酶的抑制劑，能夠阻斷腦內5-HT的合成，使5-HT濃度降低，是導致小鼠睡眠時間縮短的主要原因[4]。本實驗結果顯示PCPA明顯縮短戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠持續時間；當四逆散有效組分聯合PCPA給藥時，顯示比較四逆散有效組分組睡眠持續時間明顯縮短（P<0.05），但睡眠持續時間接近空白組。因此說明PCPA具有明顯拮抗四逆散有效組分延長小鼠睡眠時間的作用，即四逆散有效組分對睡眠的影響同樣和腦內5-HT合成酶抑制劑PCPA相關。

5-HIAA是5-HT的代謝產物。腦內的5-HT是通過單胺氧化酶使5-HT脫胺生成5-羥吲哚乙醛，再經醛脫氫酶催化生成5-HIAA；5-羥吲哚乙醛還可還原生成5-羥色醇，由腎臟排除。二是由突觸膜對5-HT的再攝入作用[5]。本實驗研究表明，四逆散有效組分使5-HT含量增加，5-HIAA含量減少，雖二者上升和下降數量關系不等，但作用趨勢符合上述的生化代謝[6]。因此，以上研究結果表明四逆散有效組分對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的作用與5-HT能神經系統的相關性尤為密切，更進一步機制尚待深入證實。

[1]羅輝昌.四逆散方證實質研究[D].北京：北京中醫藥大學，2005.

[2]李越峰.四逆散改善睡眠作用藥效物質基礎研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2009.

[3]Jouvet M.The role of monoamines and acetylcholine-containing neurons in the regulation of the sleep-waking cycle[J].Ergeb Physiol，1972，64：166-307.

[4]Zhao X，Cui XY，Chen BQ，et al.Tetrandrine，a bisbenzylisoquinoline alkaloid from Chinese herb Radix，augmented the hypnotic effect of pentobarbital through serotonergic system[J].Eur J Pharmacol，2004，506（2）：101-105.

[5]周舒，婁艾琳.5-羥色胺的生理和病理生理[M].北京：人民衛生出版社，1988：6，103.

[6]劉蓓蓓，張蘊琨.運動與腦組織中5-羥色胺及其代謝物的研究現狀[J].南京體育學院學報：自科版，2005，4（4）：29-33.