綠膿桿菌制劑對人肝癌細胞株BEL-7402的殺傷效應

郭林娜

齊齊哈爾醫學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

綠膿桿菌制劑（PA-MSHA）是用綠膿桿菌（甘露糖敏感性）菌毛株經過培養、滅活、純化后磷酸鹽（PBS）緩沖液稀釋而成，其有效的藥理部位在于甘露糖結合蛋白的菌毛，能特異性地與高甘露糖表達型的腫瘤細胞結合，誘導腫瘤細胞凋亡[1]。以往研究表明PA-MSHA改善人體的免疫狀況、對惡性腫瘤有輔助治療的作用[2-3]。本研究主要觀察PA-MSHA對肝細胞癌的體外殺傷作用，為進一步研究殺傷機制提供依據，找到治療肝癌的新藥。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

人肝癌細胞BEL-7402由哈醫大一院中心實驗室提供。RPMI-1640培養基為美國Promega公司生產，使用前加小牛血清至10%，青霉素、鏈霉素至100 U/mL。酶聯免疫檢測儀（Safie2型）奧地利公司。透射電鏡（EM208S）荷蘭菲利普公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物處理及分組 PA-MSHA原液濃度為10×107/mL，將其生理鹽水稀釋成10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL、1.25×107/mL、0.631×107/mL、0.31×107/mL濃度組，稀釋倍數為兩倍，將各組稀釋的藥物作為MTT比色實驗的實驗組，其中5×107/mL、2.5×107/mL兩組與肝癌細胞作用后，觀察兩組肝癌細胞形態學變化觀察，各實驗組藥物均用生理鹽水稀釋。

1.2.2 細胞培養 將復蘇后的肝癌細胞BEL-7402接種于在37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，培養液RPMI1640含10%小牛血清，100 U/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素，每2天換液傳代1次，觀察有90%以上細胞成單層貼壁生長，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.3 MTT比色實驗 取對數生長期人肝癌細胞BEL-7402并調節肝癌細胞懸液濃度為1×106/mL，將肝癌細胞加入96孔板，按每孔100μL種板，邊緣孔用無菌水填充，避免產生邊緣效應。對照板加入100μL RPMI1640，在實驗板中加入PA-MSHA的終濃度分別為10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL、1.25×107/mL、0.631×107/mL、0.31×107/mL。每孔設5個復孔，分別在37℃5%CO2條件下培養24 h之后每孔加入四甲基偶氮噻唑藍10μL（0.5%MTT，5 mg/mL），37℃5%CO2條件下培養4 h。離心吸掉上清液，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），置于低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在酶聯免疫檢測儀OD 490 mm處測量各孔的吸光值（A值）。取5孔平均A值，同時計算出PA-MSHA對肝癌細胞的殺傷率和存活率。記錄結果，繪制細胞在不同藥物濃度下的細胞生長曲線。1.2.4透射電鏡及光鏡觀察 取對數生長期的細胞1×106/mL加入6孔細胞培養板內蓋上蓋玻片，置于5%CO237℃條件下培養20 h，向孔內滴入2.5×107/mL PA-MSHA作為實驗組，對照組不加藥，實驗組及對照組分別與細胞共同培養12、24、40 h，棄除培養液，置于EP管中，2 000 r/min離心15 min棄上清，立即用2.5%戊二醛固定2 h，加入4℃預冷的PBS液漂洗3次，每次10 min，再用1%四氧化鋨固定15 min，接著用PBS液漂洗3次。梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋，固定包埋塊在超薄切片機上并切片。3%枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙重染色，透射電子鏡觀察并拍片同時將作用24 h的實驗組在電子顯微鏡下觀察及拍片。

1.3 統計學方法

應用SPSS 12.0軟件分析所得數據，計量資料采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下觀察細胞形態學變化

將濃度為2.5×107/mL的PA-MSHA與肝癌細胞BEL-7402培養24 h，與對照組同時置于顯微鏡下觀察：實驗組細胞核固縮、細胞形態不規整，裂解的碎片被質膜包繞，細胞形態表現為死亡的變化（圖1A）；觀察對照組肝癌細胞可見細胞形態飽滿、細胞膜完整光滑、細胞核完整呈圓形，少見死亡細胞（圖1B）。

圖1 肝癌細胞24 h細胞形態（×40）

2.2 MTT法檢測結果

將不同濃度的實驗組培養一定時間后檢測各組的平均OD值，用同樣的方法檢測對照組的平均OD值，根據OD值制圖（圖2），觀察圖2得出濃度為10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL的PA-MSHA對肝癌細胞BEL-7402的殺傷率與對照組比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）。

圖2 不同濃度PA-MSHA對BEL-7402生長的影響

2.3 透射電鏡觀察結果

透射電鏡觀察細胞超微結構變化：實驗對照組核膜、核仁完整，高爾基體、內質網、線粒體等細胞器完整清晰；一定濃度的實驗組細胞培養12、24 h后肝癌細胞出現皺縮、體積變小、變圓，細胞內可見空泡結構，核染色質凝聚、邊緣化，細胞核裂解成有膜包裹的碎塊，細胞膜包繞著一部分細胞器即凋亡小體形成；一定濃度的實驗組細胞培養40 h時肝癌細胞體積變大，線粒體內腔擴大，細胞核濃縮邊集、核碎裂、核溶解，表現為壞死的細胞特征。見圖3～5。

圖3 對照組肝癌細胞BEL-7402 12 h電鏡下細胞形態

圖4 實驗組肝癌細胞BEL-7402 12 h電鏡下細胞形態

圖5 實驗組肝癌細胞BEL-7402 40 h電鏡下細胞形態

3 討論

目前認為惡性腫瘤的發生與細胞增殖異常、細胞凋亡下降有密切的關系，同時決定腫瘤生長速度[4]。因此，抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡將成為腫瘤治療的新方向。PA-MSHA能特異性地與高甘露糖表達型的腫瘤細胞結合，誘導腫瘤細胞凋亡[1]，且國內也有報道[5-7]，PA-MSHA在肺癌、膀胱癌、宮頸癌等惡性腫瘤的治療中起到良好的效果。肝癌發病率為癌癥中第6位，病死率第3位[8]，惡性程度高，治療效果差，尋找高效的治療藥物已經提上日程。

本研究將不同濃度的PA-MSHA與肝癌細胞BEL-7402在體外培養，通過電子顯微鏡對細胞形態變化的觀察，初步發現PA-MSHA對肝癌細胞BEL-7402有殺傷作用。進一步采用MTT檢測不同濃度的PA-MSHA對肝癌細胞BEL-7402的殺傷效應，最后利用透射電鏡確定PA-MSHA對肝癌細胞BEL-7402的殺傷機制。MTT實驗證明，PA-MSHA對肝癌細胞的殺傷效應非常明顯，此殺傷效用隨著濃度的增大而增強表現為量效關系，在濃度較低時，與對照組相比較對肝癌細胞BEL-7402殺傷作用沒有顯著性差異，當藥物濃度達到10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL時，藥 物 對 肝 癌 細 胞BEL-7402的殺傷效用差異顯著（P＜0.01）；透射電鏡觀察結果表明：肝癌細胞于12、24 h表現典型的細胞凋亡形態特征：肝癌細胞出現皺縮、體積變小、變圓，細胞內可見空泡結構，核染色質凝聚、邊緣化，細胞核裂解成有膜包裹的碎塊，細胞膜包繞著一部分細胞器即凋亡小體形成；肝癌細胞于40 h發生凋亡與壞死共存的現象，但以細胞壞死形態變化為主：肝癌細胞體積變大，線粒體內腔擴大，細胞核濃縮邊集、核碎裂、核溶解，表現為壞死的細胞特征。可見，PA-MSHA對肝癌細胞BEL-7402有殺傷作用，表現為與濃度相關的量效關系，殺傷效應是通過誘導細胞凋亡與壞死而實現的。其對肝癌的治療有著非常高的研究價值，同時也可能成為抗腫瘤生長的潛在性藥物，寄希望于進一步開展實驗研究，進而指導臨床工作，最終，使腫瘤患者生命延長。

綜上所述，PA-MSHA對人肝癌細胞BEL-7402有很強的殺傷作用，發揮殺傷效用的機制初步認為是誘導細胞凋亡和壞死。

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