狹鱈魚皮膠原蛋白肽對大鼠關節炎模型中氧化應激和炎癥因子的影響

摘要[目的] 建立大鼠關節炎模型，探討狹鱈魚皮膠原蛋白肽對大鼠關節炎模型的抗氧化和抗炎機理。[方法] 采用切斷左側髕韌帶及跟腱法建立大鼠關節炎模型；治療組給予不同劑量的狹鱈魚皮膠原蛋白肽灌胃；采用HE染色觀察大鼠關節軟骨的組織病理學變化；采用酶聯免疫法檢測大鼠血清中氧化損傷相關指標丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、總抗氧化能力（TAOC）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量；采用ELISA 法測定大鼠血清炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNFα）和白介素1（IL1）的含量。[結果] 狹鱈魚皮預防組、狹鱈魚皮劑量Ⅰ組、狹鱈魚皮劑量Ⅱ組關節軟骨的損傷得到改善，骨關節炎大鼠血清中的MDA、NO的含量明顯降低，SOD和TAOC的活性有所提高，與模型組相比差異極顯著（P<0.01）。各劑量狹鱈魚皮組大鼠血清中TNFα和IL1的含量都有所降低。[結論] 狹鱈魚皮膠原蛋白肽可以有效緩解大鼠骨關節炎的癥狀，其機制可能與調控體內的氧化-抗氧化的平衡體系以及抑制炎癥因子的釋放有關。

關鍵詞狹鱈魚皮膠原蛋白；關節炎；氧化應激；炎癥因子

中圖分類號S865.1文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）26-132-03

Abstract [Objective] To establish the model of osteoarthritis rats and investigate the protective effect of collagen peptides from walleye pollock skin and its possible mechanisms concerning antioxidant and antiinflammation. [Method] Cutting off the left side of the patellar ligament and tendon was used to establish the model of osteoarthritis rats； The treatment groups were intragastric administration by different doses of collagen peptides from walleye pollock skin； Enzyme biochemical method was used to detect the levels of MDA， NO， SOD and TAOC in rats serum； ElISA was applied to detect the levels of inflammatory cytokine TNFα and IL1. [Result] All treatment groups of collagen peptides from walleye pollock skin could reduce the levels of MDA and NO and improve the content of SOD and TAOC in the rats serum. Compared with model group， the difference was extremely significant （P<0.01）. Moreover， all treatment groups could reduce the levels of TNFα and IL1 in rats serum. [Conclusion] The collagen peptides from walleye pollock skin could effectively alleviate the symptoms of osteoarthritis in rats and its mechanism may be related to maintain the balance between oxidant and antioxidant system as well as inhibit the release of inflammatory cytokine.

Key words Collagen peptides from walleye pollock skin； Osteoarthritis； Oxidative stress； Inflammatory cytokine

骨關節炎是由于關節軟骨受到損傷，進一步導致關節腔狹窄、軟骨細胞壁硬化、炎癥發生以及骨刺形成的一種退行性骨關節疾病[1-2]。氧化應激參與軟骨退化以及關節炎的形成過程，而膠原蛋白具有抗氧化作用。研究發現，鼠尾膠原可以保護過氧化氫所致的心肌細胞的氧化損傷[3]，海參膠原蛋白多肽可以抑制內皮細胞的氧化損傷，預防動脈粥樣硬化的發生[4]。狹鱈魚皮膠原蛋白肽是以狹鱈魚皮為原料，采用酶解法提純獲得具有理化活性的多肽。研究表明，狹鱈魚皮膠原蛋白多肽可以控制礦物質缺乏癥、高血壓、糖尿病等慢性病的發生[5]。然而，狹鱈魚皮膠原蛋白多肽在關節炎方面的研究鮮有報道。因此，筆者采用改良型Hulth法構造大鼠關節炎模型，觀察大鼠軟骨組織形態學指標、血清中氧化應激指標以及炎癥指標的變化，探究狹鱈魚皮膠原蛋白肽對大鼠關節炎的保護作用。

1材料與方法

1.1實驗動物

Wistar雄性大鼠，SPF級，由青島派特福德白鼠養殖專業合作社提供，實驗動物合格證號為scxk魯20130001。

1.2藥品與試劑

狹鱈魚皮膠原蛋白肽，由青島福生食品公司提供；4%多聚甲醛（萊陽經濟技術開發區精細化工廠）；水合氯醛（天津市瑞金特化學品有限公司）；EDTA2Na（北京索萊寶生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）測定試劑盒、一氧化氮（NO）測定試劑盒、總抗氧化能力（TAOC）測定試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNFα）和白介素1（IL1），購自上海慧穎生物科技有限公司。

1.3儀器

RM2016切片機（上海Leica有限公司）；BK218生物組織攤片烤片機（湖北伯納醫療科技有限公司）；Multiskan FC型酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；Spectrumlab 52紫外分光光度計（上海棱光技術有限公司）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.4試驗方法

1.4.1動物模型的復制、分組及給藥。將60只Wistar雄性大鼠隨機分為5組，分別為正常組、關節炎模型組，狹鱈魚皮預防組，狹鱈魚皮劑量Ⅰ組、狹鱈魚皮劑量Ⅱ組，每組12只。除正常組以外，其余組采用切斷左側髕韌帶及跟腱法建立大鼠關節炎模型。狹鱈魚皮預防組從手術前4周每天給予1.0 g/kg狹鱈魚皮膠原蛋白肽灌胃，直到試驗結束。狹鱈魚皮劑量Ⅰ組、Ⅱ組在造模后4周每天分別給予0.5和1.0 g/kg狹鱈魚皮膠原蛋白肽灌胃，其余組給予等體積的生理鹽水，連續8周。

1.4.2組織病理切片的制作及染色。

末次灌胃給藥后24 h，各組大鼠分別稱重，10%的水合氯醛5.0 ml/kg腹腔麻醉，取左后肢股骨下端1 cm，置于4%多聚甲醛中固定48 h，10% EDTA2Na微波脫鈣，石蠟包埋，切片。HE染色后，置于光學顯微鏡下觀察關節軟骨的組織學變化。

1.4.3血清氧化損傷和炎癥因子相關指標的測定。

末次灌胃給藥后24 h，分別給各組大鼠稱重，10%的水合氯醛5.0 ml/kg腹腔麻醉，腹主動脈取血，靜置1 min，3 000 r/min離心5 min，用移液槍吸取上清，置于已標記的離心管中，-20 ℃凍存待測。丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、總抗氧化能力（TAOC）和超氧化物歧化酶（SOD）均采用酶聯免疫法檢測。大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNFα）和白介素1（IL1）采用ELISA雙抗夾心法按照試劑盒說明書檢測。

1.5數據統計與分析使用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，結果以平均值±標準差（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，方差齊性各組之間多重比較采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane’s T2 （M）法。

2結果與分析

2.1大鼠關節軟骨的形態學變化

從圖1可以看出，正常組大鼠關節軟骨經HE染色后，關節面光滑，軟骨細胞數量多且分布均勻，潮線整齊；關節炎組大鼠，關節面粗糙，著色不均，軟骨細胞數量減少，排列紊亂，有許多空軟骨陷窩。狹鱈魚皮預防組、狹鱈魚皮劑量0.5 g/kg組、狹鱈魚皮劑量1.0 g/kg組大鼠關節軟骨的損傷程度較關節炎組大鼠輕，軟骨表面欠光滑，表層細胞丟失，可見軟骨層變薄，細胞排列較為規律。

2.2狹鱈魚皮膠原蛋白肽對關節炎大鼠血清氧化指標的影響

由表1可知，與正常組相比，關節炎模型中MDA和NO的水平顯著升高（P<0.01），SOD和TAOC的水平明顯降低（P<0.01）；與關節炎模型組相比，狹鱈魚皮膠原蛋白肽預防組、0.5 g/kg劑量組、1.0 g/kg劑量組關節炎大鼠血清中MDA和NO的水平均顯著降低（P<0.01），SOD和TAOC的濃度極顯著提高（P<0.01），且狹鱈魚皮膠原蛋白肽預防組、1.0 g/kg劑量組的效果優于劑量Ⅰ組。

2.3狹鱈魚皮膠原蛋白肽對關節炎大鼠血清炎性因子的影響

從圖2可以看出，關節炎大鼠血清中的TNFα和IL1的含量顯著升高，與正常組相比差異極顯著（P<0.01）。狹鱈魚皮膠原蛋白肽預防組、0.5 g/kg劑量組、1.0 g/kg劑量組均可以有效改善血清中TNFα和IL1含量的升高，與關節炎模型組相比差異極顯著（P<0.01）。

3討論

過氧化物陰離子自由基（O2-）是體內氧自由基的主要來源，它可以進一步衍化為羥自由基（-OH）和過氧化氫（H2O2）等對機體有害的自由基。這些氧自由基可以破壞關節軟骨中膠原蛋白的結構，使透明質酸和蛋白多糖發生解聚和降解，進而導致關節軟骨損傷[6]。一般而言，當機體的抗氧化防御機制失衡時，機體內的脂質過氧化物丙二醛（MDA）的含量就會增加。Sarban S等[7]發現關節炎病人的血清和關節液中的MDA水平升高。一氧化氮（NO）是體內活性氮自由基（RNS）的主要來源，它可以抑制軟骨細胞合成多糖，抑制SOD的活性，增加軟骨細胞的凋亡[8-9]。

正常生理狀態下，機體產生的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）可以被機體的抗氧化防御體系所清除，維持生成和清除的動態平衡。體內的抗氧化物質包括而酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，而酶類抗氧化劑主要包括超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、過氧化物酶（CAT）等，這些抗氧化防御體系可以保護細胞免受氧化應激的損傷[10]。另外，鐵離子還原抗氧化劑能力和總自由基清除抗氧化能力的測定是用來評估總的抗氧化能力（TAOC）。該試驗中，與模型組相比狹鱈魚皮膠原蛋白多肽預防組、狹鱈魚皮膠原蛋白多肽劑量Ⅰ組、Ⅱ組關節炎大鼠血清中的NO、MDA的水平均有所降低，SOD和TAOC的活力均有所提高，且預防組、狹鱈魚皮膠原蛋白多肽1.0 g/kg劑量組的作用優于0.5 g/kg劑量組。從形態學上來看，大鼠關節軟骨的HE染色結果表明狹鱈魚皮膠原蛋白多肽預防組、劑

量Ⅰ組、Ⅱ組確

實可以降低關節軟骨的損傷程度。由此可見，狹鱈魚皮膠原蛋白肽可能通過維持體內的抗氧化防御體系的平衡保護關節軟骨免受損傷，延緩關節炎的發展。

腫瘤壞死因子α（TNFα）和白介素1（IL1）是關節炎病變形成過程中的關鍵炎性細胞因子[11]，它們可以誘導關節軟骨細胞和滑膜細胞產生白介素8（IL8）、白介素6（IL6）等促炎因子以及蛋白酶和前列腺素E2（PGE2）的合成[12]。因此，筆者開展了狹鱈魚皮膠原蛋白多肽對大鼠關節炎模型中炎癥因子作用的研究，結果發現狹鱈魚皮膠原蛋白多肽可以降低關節炎大鼠血清中的TNFα和IL1的水平。因為TNFα和IL1是炎癥發生的始動因素，所以狹鱈魚皮膠原蛋白多肽降低關節炎大鼠血清中的TNFα和IL1的水平，可能與延緩關節炎的發展有關。

綜上所述，狹鱈魚皮膠原蛋白多肽可以有效緩解大鼠關節軟骨的損傷，其治療關節炎的作用可能與維持機體的抗氧化防御體系的平衡以及降低炎癥因子的表達有關。

參考文獻

[1]

LOTZ M.Osteoarthritis year 2011 in review：Biology[J].Osteoarthritis cartilage，2012，20（3）：192-196.

[2] SINUSAS K.Osteoarthritis：Diagnosis and treatment[J].Am Fam Physician， 2012，85（1）：49-56.

[3] 包馨慧，李曉梅，陶 靜，等.鼠尾膠原在心肌細胞氧化損傷中的保護作用[J].中國組織工程研究，2014，18（52）：8643-8649.

[4] 趙芹.海參膠原蛋白多肽抗氧化活性的研究[D].青島：中國海洋大學，2008：1-77.

安徽農業科學2015年

[5] GUO L，HARNEDY P A，ZHANG L，et al.In vitro assessment of the multifunctional bioactive potential of Alaska pollock skin collagen following simulated gastrointestinal digestion[J].J Sci Food Agric，2015，95（7）：1514-1520.

[6] OSTALOWSKA A，BIRKNER E，WIECHA M，et al.Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in synovial fluid of patients with primary and secondary osteoarthritis of the knee joint[J].Osteoarthritis cartilage，2006，14 （2）：139-145.

[7] SARBAN S，KOCYIGIT A，YAZAR M，et al.Plasma total antioxidant capacity，lipid peroxidation，and erythrocyte antioxidant enzyme activities in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J].Clin Biochem，2005，38（11）：981-986.

[8] ALDERTON W K，COOPER C E，KNOWLES R G.Nitric oxide synthases：structure，function and inhibition[J].Biochem J，2001，357（Pt3）：593-615.

[9] HASHIMOTO S，TAKAHASHI K，AMIEL D，et al.Chondrocyte apoptosis and nitric oxide production during experimentally induced osteoarthritis[J]. Arthritis Rheum，1998，41（7）：1266-1274.

[10] FINKEL T，HOLBROOK N J.Oxidants，oxidative stress and the biology of ageing[J].Nature ，2000，408（6809）：239-247.

[11] WOJDASIEWICZP，PONIATOWSKI L A，SZUKIEWICZ D.The role of inflammatory and antiinflammatory cytokines in the pathogenesis of osteoarthritis[J].Mediators Inflamm，2014：19.

[12] ERTENLI I，KIRAZ S，CALGUNERI M，et al.Synovial fluid cytokine levels in Behcet's disease[J].Clin Exp Rheumatol，2001，19（5）：37-41.