Beclin1和LC3在食管癌組織中的表達水平和臨床意義

夏彥清 趙 松 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450002)

河南省北部地區(qū)是全國食管癌高發(fā)區(qū)之一，然而有關(guān)食管癌的發(fā)病機制仍待研究。近年來有關(guān)自噬的研究表明其活性的變化與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔1〕，微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3，LC3)和自噬相關(guān)蛋白1(Beclin1)均是參與自噬體形成的重要基因〔2，3〕。本研究通過免疫組化方法檢測自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3在食管鱗癌和腺癌組織中的表達水平，分析其與臨床病理因素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 89例食管癌標(biāo)本、36例癌旁組織和36例正常食管組織均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2010年10月至2011年10月手術(shù)切除標(biāo)本存檔蠟塊。在89例食管癌標(biāo)本中，男55例，女34例，中位年齡61歲，全部標(biāo)本重新經(jīng)病理證實有45例食管鱗狀細胞癌和44例腺狀細胞癌，其中高分化鱗癌16例，高分化腺癌14例，中分化鱗癌14例，中分化腺癌16例，低分化鱗癌15例，低分化腺癌14例;浸潤到深肌層及以上44例，未浸潤到深肌層45例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。術(shù)前均未行放化療。

1.2 主要試劑及方法 兔抗人Beclin1、LC3多克隆抗體和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)免疫組化試劑盒均購于北京博奧森生物科技有限公司，試劑盒內(nèi)包括：生物素標(biāo)記的二抗(山羊抗兔)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，正常山羊血清。按免疫組織化學(xué)SP法進行染色。染色前蠟塊標(biāo)本進行烤片后脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，正常山羊血清封閉，一抗4℃冰箱放置12 h，再加入標(biāo)記有生物素的二抗，室溫孵育30 min，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，然后室溫孵育15 min，行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。用已知陽性片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定與標(biāo)準(zhǔn) Beclin1、LC3陽性表達均為棕黃色顆粒，Beclin1主要分布于胞膜和胞質(zhì)，LC3主要分布于胞質(zhì)，采用半定量法對表達于食管鱗癌和腺癌組織的Beclin1和LC3進行判定。用雙盲法在每張切片上隨機觀察5個高倍視野(400倍)，每個視野計數(shù)100個細胞，按胞質(zhì)或胞膜發(fā)現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞標(biāo)志，評判標(biāo)準(zhǔn)〔4〕：按染色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分 (染色深淺與背景著色相對比);再按陽性細胞百分比：0分為陰性，1分為陽性細胞0% ～10%，2分為陽性細胞11%～50%，3分為陽性細胞51% ～75%，4分為陽性細胞76%～100%;最后將兩者得分相乘得最終分?jǐn)?shù)，≤3分為陰性 (-)，＞3分為陽性 (+)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1和LC3在食管癌組織和食管正常組織中的表達36例食管正常組織中，Beclin1和LC3的陽性表達率分別為88.9%(32/36)和80.6%(29/36)，明顯高于食管癌組的表達率47.2%(42/89)和40.4%(36/89)，兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。見圖1。

圖1 Beclin1，LC3在食管鱗癌和腺癌中的陽性表達(SP，×400)

2.2 Beclin1和LC3在食管鱗癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系 Beclin1和LC3在食管鱗癌中的表達與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，與年齡、性別無關(guān)，即腫瘤分化程度越低、浸潤程度越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期越高，Beclin1和LC3的表達越低。見表1。

2.3 Beclin1和LC3在食管腺癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系 Beclin1和LC3在食管腺癌中的表達與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，與年齡、性別無關(guān)，即腫瘤分化程度越低、浸潤程度越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期越高，Beclin1和LC3的表達越低。Beclin1和LC3在食管鱗癌和腺癌中的表達無差異(P1=0.169，P2=0.730)。見表2，表3。

2.4 Beclin1和LC3在食管癌中表達的相關(guān)性 Beclin1和LC3雙陽性24例，雙陰性35例，僅Beclin1陽性12例，僅LC3陽性18例。分析結(jié)果顯示Beclin1和LC3在食管鱗癌和腺癌中的表達呈正相關(guān)(r=7.935，P=0.005)。

表1 Beclin1和LC3在食管鱗癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系(n)

表2 Beclin1和LC3在食管腺癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系(n)

表3 Beclin1和LC3在食管鱗癌和腺癌中的表達比較(n)

3 討論

目前大家普遍認(rèn)為自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機制，細胞通過這種機制實現(xiàn)氨基酸、核酸等生物大分子的循環(huán)利用〔5〕，清除自身衰老和失去功能的細胞，維持正常的細胞新陳代謝，保護機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。研究表明，自噬不但能夠自我消化而且過程很快，具備可誘導(dǎo)性，在多種誘發(fā)因素的作用下(如外界的缺氧，缺糖〔6〕)，可以實現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白的快速合成，接著出現(xiàn)大量的自噬體〔7〕，這種應(yīng)激反應(yīng)條件下自噬活性的變化對疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重大意義。

Liang等〔8〕發(fā)現(xiàn) Beclin1蛋白在正常乳腺上皮組織中高水平表達，但在乳癌組織中表達水平明顯下調(diào)，研究還發(fā)現(xiàn)，從正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤到上皮性卵巢癌組織，Beclin1的表達逐漸下調(diào)〔8〕。之后大量的研究表明，Beclin1 在卵巢癌〔9〕、喉癌〔10〕、肺癌〔11〕和消化道腫瘤〔12〕等多種腫瘤組織中的表達與相應(yīng)的正常組織的細胞相比都明顯降低，這表明自噬在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展方面有一定的作用。而LC3作為另外一種自噬相關(guān)基因，也廣泛應(yīng)用于自噬水平的檢測，并已被作為測定自噬表達水平的特異性方法之一〔13〕。本研究結(jié)果說明自噬在食管鱗癌和腺癌的發(fā)展過程中可能與腫瘤的發(fā)展和演進有關(guān)。

腫瘤的難治性在于易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，從而影響患者的生存期，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與浸潤深度是和食管癌預(yù)后明顯相關(guān)的，所以臨床分期愈晚、病理分級愈高，其侵襲與轉(zhuǎn)移能力也越強。本實驗提示目前在腫瘤治療過程中，出現(xiàn)的局部腫瘤未完全控制、復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移可能與自噬的作用有關(guān)，為今后治療腫瘤提供了一個方向;但是自噬的調(diào)控機制比較復(fù)雜，而且機制尚不清楚。大量的文獻研究表明，當(dāng)化療、放療后，腫瘤細胞會產(chǎn)生大量的破損細胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，而自噬可及時清除這些有害物質(zhì)，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時間和條件;而且腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點，通過自噬對生物大分子進行循環(huán)再利用〔7，14～16〕。也有研究表明自噬基因敲除的動物自發(fā)腫瘤增多;相反，自噬基因敲除后，增加了化療、放療、免疫治療的敏感性〔17〕。因此，需要正確地調(diào)節(jié)自噬水平，過高或過低都會對機體產(chǎn)生不利的影響，所以不能簡單地通過降低自噬水平來達到治療腫瘤的目的，而需要進一步研究，通過正確調(diào)節(jié)自噬水平的高低來增強藥物等治療的有效性，同時有效維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抑制腫瘤發(fā)生。

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