血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶3過表達對乳腺癌細胞凋亡的影響

郭紅艷 孫曉杰 劉秀財 樊 麗 于英君

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

近幾年的研究表明，血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(SGK3)可能是多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細胞磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的一個功能性交匯點，可被應(yīng)激因素誘導(dǎo)激活，在調(diào)節(jié)離子通道、細胞增殖、細胞存活和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用〔1〕。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳類SGK的異構(gòu)酶有SGK1、SGK2和SGK3(也稱CISK)三種，迄今為止，研究較多的是SGK1，其對鼠的毛囊形態(tài)發(fā)生、自身穩(wěn)定以及腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等具有重要作用〔2，3〕。而關(guān)于SGK3的研究國內(nèi)尚未見報道，國外的報道也較少，有文獻報道SGK3可能參與了細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和Wnt信號通路〔4〕，但其在人類細胞中的生物學(xué)功能至今尚未闡明。最新研究顯示，CISK/SGK3對白細胞介素-3(IL-3)撤退所誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡具有保護作用〔5〕。在此基礎(chǔ)上，本文將研究CISK/SGK3與乳腺癌細胞凋亡發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及其相關(guān)機制，初步闡明CISK/SGK3的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質(zhì)粒 乳腺癌細胞MCF7由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供，細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。本研究所用pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒由美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院夏獻民博士惠贈，pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒含有人SGK3 cDNA基因，全長為1.3 kb，含BamH I和Xho I酶切位點。

1.1.2 主要試劑和抗體 RPMI1640、G418購自Gibco BRL公司;細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購自英國Nunc公司;BamH I和Xho I購自寶生物工程有限公司;biozol、RT-PCR試劑盒購自杭州博日科技有限公司;凋亡檢測試劑盒購自嘉美生物科技有限公司;SGK3多克隆抗體購自 CST公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自康為世紀科技有限公司;增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光試劑購自普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP-N1-SGK3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)SGK3的全長cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并分別在上游引物和下游引物前加上限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamH I識別序列及接頭，通過PCR方法從pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒中擴增SGK3基因。上游引物序列為5'CCGCTCGAGACCATGGCCCTGAAGATTC 3'，下游引物序列為5'CGC GGA TCC AAA AAT AAG TCT TCT G 3'。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后與同樣酶切的載體pEGFP-N1連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3。陽性菌株送至上海Invitrogen公司進行測序，測序結(jié)果與Genbank源基因用網(wǎng)絡(luò)軟件ClustalW進行基因比對，同時提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 采用GenEscortTMⅠ 進行細胞轉(zhuǎn)染，生長良好的乳腺癌細胞株(MCF7)于轉(zhuǎn)染前24 h接種到6孔板中，待細胞總面積達到60% ～80%，取3 μg pEGFP-N1-SGK3質(zhì)粒和空載體pEGFP-N1質(zhì)粒分別進行基因轉(zhuǎn)染(具體操作按說明書進行)，用G418篩選獲得陽性轉(zhuǎn)染細胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，轉(zhuǎn)染細胞通過蛋白質(zhì)印跡法鑒定。

1.2.3 細胞增殖實驗 采用四甲基唑藍(MTT)法繪制細胞生長曲線，取對數(shù)生長期的各組細胞，用0.25%胰酶消化后計數(shù)，按每孔5×102細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)4個平行孔，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每天取出一塊培養(yǎng)板，加5 g/L的MTT 20 μl于各孔中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，各孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，于微量振蕩器振蕩15 min后用酶標儀測定波長570 nm的吸光度值，取4個孔的平均值，以時間為橫坐標，A570值為縱坐標作圖，觀察細胞的增殖情況。

1.2.4 細胞凋亡檢測 細胞培養(yǎng)48 h，常規(guī)消化處理各組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，按細胞凋亡雙染色試驗(Annexin V-FITC/PI)試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡，資料經(jīng)ModFitL T軟件分析。

1.2.5 凋亡相關(guān)基因表達檢測 取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)48 h后，用Biozol試劑提取各組細胞總RNA，用RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進行半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RI-PCR)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計bad、bcl-xl及內(nèi)參β-肌動蛋白(βactin)引物，引物由生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司合成，引物序列及擴增片段大小如下：β-actin：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，擴增產(chǎn)物長 263 bp;bad：5'-CCATCCCTTCGTCGTCCTC-3';5'-GCTCCGGCAAGCATCATC-3'，擴增產(chǎn)物長度 162 bp;bcl-xl：5'-CGGGCATTCAGTGACCTGAC-3'， 5'-TCAGGAACCAGCGGTTGAAG-3'，擴增產(chǎn)物長度151 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，退火30 s(bad和 bcl-xl的退火溫度分別為51℃、52.3℃)，72℃ 延伸 60 s，循環(huán) 30 次，最后 72℃ 延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，AlphaImager圖像分析系統(tǒng)拍照、結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3的鑒定 重組質(zhì)粒pEGFPN1-SGK3經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明所獲SGK3酶切片段的大小與預(yù)期相符，經(jīng)DNA測序結(jié)果表明，所獲克隆序列與理論序列一致。見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3酶切電泳圖

2.2 轉(zhuǎn)染細胞中SGK3蛋白表達的鑒定 重組質(zhì)粒pEGFPN1-SGK3和空載體質(zhì)粒pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染MCF7后，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。用抗SGK3抗體通過Western印跡方法檢測發(fā)現(xiàn)，SGK3在轉(zhuǎn)染細胞中能夠有效地表達，而親本細胞和轉(zhuǎn)染空載體的細胞中未檢測到內(nèi)源性SGK3的表達。見圖2。

圖2 Western印跡檢測SGK3蛋白在MCF7轉(zhuǎn)染細胞系中的表達

2.3 SGK3促進腫瘤細胞的生長 為了研究SGK3的過表達對細胞增殖的影響，通過MTT法繪制了各組轉(zhuǎn)染細胞的生長曲線，與親本細胞及轉(zhuǎn)染空載體組細胞相比，轉(zhuǎn)染SGK3的細胞生長速度明顯增快。見圖3。

2.4 SGK3抑制腫瘤細胞的凋亡 各組細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，在雙變量的FCM散點圖上，MCF-7親本細胞凋亡率為：第二象限(0.1%)+第四象限(8.9%)=9.0%，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pEGFP-N1細胞組凋亡率為：第二象限(1.4%)+第四象限(8.6%)=10.0%;轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3細胞組凋亡率為：第二象限(1.2%)+第四象限(4.4%)=5.6%。可見，SGK3過表達可明顯抑制乳腺癌MCF7細胞凋亡。見圖4。

圖3 外源性SGK3的過表達對MCF7細胞增殖的影響

圖4 流式細胞術(shù)檢測MCF7細胞凋亡的散點圖

2.5 RT-PCR結(jié)果 與MCF7親本細胞比較，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pEGFP-N1細胞的bad和bcl-xl表達無明顯變化;與以上兩組比較，SGK3過表達可致 MCF7細胞 bad mRNA表達降低和bcl-xl mRNA表達升高。見圖5。

圖5 各組細胞bcl-xl、bad mRNA表達

3 討論

SGK是1993年發(fā)現(xiàn)的一個與蛋白激酶B(PKB)第二信使蛋白具有極高同源性的Ser/Thr蛋白激酶，該基因全長2.4 kb，序列高度保守，在各種哺乳動物組織和細胞系中均有表達〔6〕。SGK是一個由多個成員組成的基因家族，其中與SGK(即SGK1)同源程度最高的是SGK2和SGK3，他們的催化結(jié)構(gòu)域具有高達80%的氨基酸序列相同，但很多方面具有顯著的不同之處〔7～9〕。在對SGK3功能的研究中發(fā)現(xiàn)，SGK3定位于細胞的內(nèi)體(endosome)，作為PI3K的下游分子，SGK3也能磷酸化Akt的一些底物如 Forkhead 家族成員轉(zhuǎn)錄因子(FKHRL1)〔10，11〕;另外，研究發(fā)現(xiàn)SGK3與情景記憶和恐怖記憶關(guān)系更密切，主要通過促進谷氨酸受體1(GLUR1)的表達增強記憶〔12〕。雖然已有證據(jù)顯示，SGK3在某些腫瘤的形成過程中可能擔(dān)任著重要的角色，也有報道指出，SGK3對由于IL-3撤退所誘導(dǎo)的乳腺癌細胞MCF7凋亡具有保護作用;但迄今為止，有關(guān)SGK3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制卻未見報道。

本實驗中，為了研究外源SGK3基因生物學(xué)功能，首先構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3，進而將該質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染MCF7細胞，通過Western印跡方法對轉(zhuǎn)染基因的蛋白質(zhì)表達進行了鑒定，且未檢測到細胞內(nèi)源性SGK3蛋白的表達。在隨后的細胞生長曲線中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SGK3基因的細胞其生長速度明顯加快。本實驗RT-PCR結(jié)果顯示外源SGK3基因的過表達可使腫瘤細胞bcl-xl mRNA表達上調(diào)，bad mRNA表達下調(diào)，提示外源SGK3基因可通過影響凋亡相關(guān)基因的表達而抑制細胞凋亡。

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