突觸前膜列陣蛋白1在成年期甲狀腺功能減退癥大鼠前額葉的表達

朱洋波 寧 丹 王 芬 朱德發 (安徽醫科大學第一附屬醫院老年內分泌科，安徽 合肥 230022)

成年期甲狀腺功能減退 (甲減)可導致人或動物腦損傷以及學習記憶功能受損，受損的機制可能與甲狀腺激素缺乏所致的突觸可塑性改變有關〔1〕，后者被認為是學習記憶的神經基礎。突觸前膜列陣蛋白1(syntaxin-1)廣泛分布于正常大腦皮質神經元，是重要的突觸囊泡相關蛋白，位于神經元的突觸前膜上，主要參與突觸囊泡膜的融合與遞質釋放，并與突觸可塑性調節有關〔2〕。前額葉是與學習記憶有關的關鍵腦區，報道顯示成年大鼠額葉神經遞質釋放受甲狀腺激素的影響〔3〕，但相關機制報道較少。本研究通過腹腔注射丙硫氧嘧啶 (PTU)誘導建立成年期甲減大鼠模型，探討甲減對額葉內syntaxin-1表達的影響及左旋T4替代治療后syntaxin-1的恢復程度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康3月齡雄性SD大鼠45只，普通級，體質量250～300 g，購自南京實驗動物中心，動物證號：SCXK(蘇)200220031。標準實驗條件下喂養，自然采光，所有大鼠接受標準嚙齒類食物，自由進食、飲水。

1.2 主要儀器及試劑 EPS-300電泳儀、VE-180垂直電泳槽、VE-186轉膜電泳槽(上海天能科技有限公司)。PTU、左甲狀腺素(左旋T4，Sigma公司);T3、T4放射免疫試劑盒(北方生物技術研究所);山羊抗大鼠抗syntaxin-1蛋白多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司);HRP標記的抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗(上?？党缮锕こ逃邢薰?。

1.3 模型制備 所有大鼠適應性喂養1 w后，隨機分為4組：甲減組(H組，n=11)，小劑量左旋T4替代治療組(T4-5組，n=12)、大劑量左旋T4替代治療組(T4-20組，n=12)、對照組(C組，n=10)。甲減組大鼠每日腹腔注射PTU 1 mg/100 g體重(BW)共6 w;左旋T4替代治療組大鼠每日腹腔注射 PTU 1 mg/100 g BW，第5周起小劑量組每日給予左旋T45 μg/100 g BW 2 w，大劑量組大鼠每日給予左旋T420 μg/100 g BW 2 w;對照組大鼠每日腹腔注射同體積生理鹽水6 w。每周測體重一次，并根據體重調整給藥劑量。本實驗研究遵循“實驗用動物管理和使用指南”。

1.4 標本制備 血清制備：造模結束24 h后，所有大鼠稱重，給予每100 g體重0.3 ml的水合氯醛麻醉后打開胸腔，腹主動脈取血，大約每只大鼠取血1.5 ml后，迅速以5 000 r/min離心10 min后，取血清置于-20℃冰箱保存待測T3、T4?？紤]到甲狀腺素分泌存在節律性，以隨機的方式在上午9：00～11：00完成所有大鼠的取血工作。取血后迅速將大鼠斷頭處死，冰上分離額葉組織，置于-80℃冰箱保存。

1.5 甲狀腺素水平測定 采用放射免疫法測定T3、T4水平。

1.6 突觸小體提取 取額葉置于玻璃勻漿器中，加入蛋白裂解液(10 mmol/L HEPES，1 mmol/L EDTA，10%sucrose，pH 7.4，蛋白酶抑制劑cocktail 2 μl/ml)，冰上勻漿。然后4℃下離心8 min，取上清離心15 min，所獲得沉淀即為粗制突觸小體，向沉淀中加入等體積上述蛋白裂解液重懸浮，用BCA法進行蛋白定量。將所有樣品中加入等量4×蛋白電泳加樣緩沖液(3∶1)，混勻，煮沸10 min，-80℃冰箱保存備用。

1.7 Western印跡 各樣本分別取25 μg總蛋白依次進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(抗syntaxin-1蛋白多克隆抗體，1∶200)，室溫孵育2 h，0.05%PBS-T洗10 min×3次后加HRP標記的兔抗山羊IgG和內參抗體(HRP標記的抗 GAPDH 抗體，1∶10 000)，室溫孵育 1.5 h，0.05%PBS-T洗10 min×3次，ECL顯色后曝光并顯影。對條帶進行相對光密度分析，通過syntaxin-1與內參GAPDH的條帶光密度值的比值間接反映syntaxin-1的表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠血清T3、T4水平 與C組相比，H組大鼠血清T3、T4顯著降低(P＜0.05)，分別為對照組的 52.30%和77.92%;小劑量左旋T4替代治療后(T4-5組)，大鼠血清T3、T4恢復至正常水平(P＞0.05)，分別為對照組的96.92%和99.71%;而給予大劑量治療后(T4-20組)，大鼠血清T3、T4明顯增高(P＜0.01)，分別為對照組的170.8%和175.1%。見表1。

表1 各組大鼠血清T3、T4水平比較( s，nmol/L)

表1 各組大鼠血清T3、T4水平比較( s，nmol/L)

與對照組比較：1)P＜0.05，2)P ＜0.01

組別 n T3 T4 10 0.65±0.05 55.20±3.56 H組 11 0.34±0.042) 43.01±2.951)T4-5組 12 0.63±0.05 55.04±3.77 T4-20組 12 1.11±0.102) 96.68±6.422)C組

2.2 各組大鼠前額葉syntaxin-1表達的改變 甲減組大鼠額葉內 syntxin-1蛋白表達顯著減少(P＜0.05)，為對照組的74.58%。給予小劑量和大劑量左旋T4替代治療后，syntxin-1的表達分別為對照組的85.35%和100.54%，與對照組比較差異均無統計學意義(P＞0.05);與甲減組比較，小劑量左旋T4替代治療后syntxin-1蛋白表達增加了10.77%，差異無統計學意義(P＞0.05)，而大劑量治療后syntxin-1蛋白表達較甲減組增加了25.96%，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組前額葉突觸小體內syntaxin-1的表達

3 討論

維持成年期哺乳動物中樞神經系統結構及功能的分子基礎可能受甲狀腺激素的影響，其中包括對突觸可塑性的調節以及一些重要突觸蛋白表達的調控〔4〕。突觸蛋白syntaxin-1是參與調節中樞系統神經遞質釋放的重要蛋白之一，報道顯示，成年期甲狀腺激素缺乏可影響syntaxin-1蛋白在大鼠腺垂體的表達，其表達量明顯下降〔5〕。本研究提示在成年期甲狀腺激素缺乏可影響syntaxin-1蛋白在前額葉內的表達。甲減狀態下syntaxin-1蛋白的減少可能是由于甲狀腺激素缺乏所致的蛋白合成減少，另一方面可能與甲減引起的神經元的形態學改變有關。研究表明〔6〕在甲減狀態下大鼠腦組織內神經元的樹突棘數量和密度減少。而Hepp等〔7〕發現syntaxin-1在成年甲減大鼠腎上腺組織內的表達增加，這與甲減下此蛋白在腦內表達的研究結果不一致，可能是由于不同的組織對甲狀腺激素缺乏的反應性不同。

通過甲狀腺激素替代治療，甲減腦損傷分子水平的改變能夠得到恢復，但恢復程度存在爭議。本研究的結果提示左旋T4替代治療能夠使成年期甲減syntaxin-1蛋白表達恢復，劑量增加會使syntaxin-1蛋白的表達恢復得更好，相似的結果也出現在對前額葉其他蛋白、海馬內突觸蛋白以及形態學研究中。而本課題組在同樣實驗條件下的研究顯示，甲減下海馬的munc-18〔8〕和 synaptotagmin-1〔9〕在甲狀腺激素恢復正常時的表達與對照組相比有顯著差異，劑量增加可以使上述蛋白表達水平與對照組相同，效果顯著，這種現象出現的原因可能是大劑量T4替代治療可使甲狀腺激素更充分地占據核受體，從而更有效地發揮其生理活性。有文獻報道〔10〕甲減大鼠給予單次大劑量T3治療能使其核受體飽和度達到86%，而多次小劑量T3治療僅使其核受體飽和度達到49%。甲減腦損傷的形態學研究〔6〕也顯示，高劑量甲狀腺激素替代治療能夠使減少的樹突棘數目恢復至正常的88%，而低劑量僅能使其恢復至正常的68%，高劑量較低劑量明顯有效。另一方面，本文的治療時間為2 w，有研究顯示小劑量左旋T4替代治療6 w能使成年期甲減大鼠海馬依賴性的認知缺損完全恢復，這可能提示成年期甲減腦損害的恢復亦與替代治療時間有關。

綜上，本研究結果表明成年期甲減大鼠前額葉內syntaxin-1蛋白表達減少;左旋T4替代治療能使其改善，當血清甲狀腺激素替代至正常水平時，syntaxin-1蛋白的表達與對照組無顯著差異;替代治療至血清甲狀腺激素水平高于正常時，syntaxin-1蛋白的表達更接近于對照組。

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2 高亞兵，彭瑞云，張志毅，等.硝酸羥胺對大鼠腦Syvnaptobrevi和Syntaxin的表達的影響〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2007;16(3)：274-7.

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6 Gould E，Allan MD，McEwen BS.Dendritic spine density of adult hippocampal pyramidal cells is sensitive to thyroid hormone〔J〕.Brain Res，1990;525(2)：327-9.

7 Hepp R，Grant NJ，Chasserot-Golaz S，et al.The hypophysis controls expression of SNAP-25 and other SNAREs in the adrenal gland〔J〕.Neurocytol，2001;30：789-800.

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