骨髓間充質干細胞抑制輻射誘導C57BL/6小鼠胸腺瘤的發生

姚月良 陳玉丙 韓志龍 王鐵君 葛立本 (吉林大學第二醫院放療科，吉林 長春 130041)

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有干細胞特征及多向分化潛能，在特定條件下可分化為多種細胞，包括成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。MSCs對組織損傷具有修復及再生作用，如脊髓損傷、腦、胰腺炎、肝臟纖維化和皮膚光老化〔1～8〕，MSCs還具有免疫調節、抗腫瘤能力和降低腫瘤細胞轉移等作用〔9〕。文獻報道X-射線照射可誘生幼齡小鼠胸腺瘤的形成〔10〕，這種輻射造成的組織損傷需要累積，甚至到老年才能觀察到癌變。因此，本研究擬應用MSCs的組織損傷修復作用，將MsCs注射同系小鼠，觀察其對輻射誘導胸腺瘤形成的影響，探討輻射損傷的防治，從而預防腫瘤的發生。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM培養基(Invitrogen，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，Percoll分離液、胰蛋白酶、DAPI、CO2培養箱(Sigma公司，美國);飛利浦深部X線放射治療機(美國)。C57BL/6純系小鼠，清潔級，雌性，體重(13±2)g，由吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 輻射誘發胸腺淋巴瘤動物模型制備〔10〕按照Kaplan經典方法，采用深部X射線治療機照射，電壓200 kV，電流10 mA，濾板1.0 mm Al和0.5 mm Cu。全身X射線照射，球靶距離50 cm，劑量率0.287 Gy/min，每次照射劑量1.75 Gy，每周1次，共4次，總劑量7 Gy。于末次照射后6個月殺鼠。

1.2.2 MSCs的分離、培養、標記及靜注〔1～8〕處死乳鼠，無菌取股骨，DMEM培養液沖洗骨髓腔后，制成單細胞。應用Percoll分離液分離出單個核細胞。計數，以每瓶(4±2)×106個細胞接種于培養瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。每周換液2次。當細胞長滿瓶底面積的80% ～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2進行傳代培養，傳到第3代備用。注射前1 d，棄去MSCs培養瓶中的培養液，用PBS洗滌2次，加入DAPI工作液10 ml/瓶，放入培養箱中培養1 h后，棄去DAPI，加入含15%胎牛血清的DMEM培養液，常規培養。24 h后，倒置熒光顯微鏡觀察細胞標記情況。收集細胞，調整DAPI標記的MSCs濃度為2.0×106個/ml，取0.5 ml經尾靜脈注入輻射誘發胸腺瘤模型小鼠，每周1次，共4次。

1.2.3 病理學分析 取胸腺組織，10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。根據胸腺瘤病理組織學特征，光鏡下觀察胸腺瘤發生率。

2 結果

2.1 病理學分析輻射誘導的胸腺瘤 光鏡下觀察可見假照射組小鼠胸腺組織結構正常，皮髓質結構清晰，淋巴細胞形態規則，呈圓形或卵圓形。輻射誘導模型組C57BL/6小鼠正常胸腺結構被破壞，未見正常淋巴細胞，淋巴樣腫瘤細胞彌漫分布，胞核大，深染，形成典型的淋巴瘤特征細胞。MSCs注射組可見小鼠胸腺結構，未見淋巴瘤特征性細胞。見圖1。

圖1 病理學分析輻射誘導小鼠胸腺瘤組織(×100)

2.2 MSCs抑制輻射誘導小鼠胸腺瘤的發生 輻射誘導模型組小鼠胸腺瘤的發生率〔72.73%(8/11)〕明顯高于MSCs注射組〔20%(2/10)〕，組間比較差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

MSCs是一種成體干細胞，在特定環境下可誘導分化為中胚層和外胚層細胞，在組織損傷時，可歸巢至受損部位，參與組織修復和再生〔11〕。但對腫瘤的作用卻是雙向性的，一方面通過旁分泌的方式促進腫瘤細胞的生長〔12〕，將黑色素瘤 B16與MSCs一起接種于異基因C3H鼠皮下，可觀察到腫瘤生長，而黑色素瘤 B16和 MSCs單獨接種，未見腫瘤生長〔13〕;另一方面MSCs卻抑制腫瘤細胞的生長，將MSCs與結腸癌細胞株H1D2一起接種于小鼠皮下，7～14 d后可觀察到結腸癌生長被完全抑制;MSCs還可抑制9神經膠質瘤大鼠模型的腫瘤生長，腫瘤體積明顯小于對照組，延長了大鼠的生存期〔14〕。

雖然MSCs對腫瘤的作用尚存爭議，但MSCs對損傷的組織確有修復作用〔1～8〕，包括電離輻射造成的損傷〔15〕。因此，本研究在應用Kaplan方法成功建立輻射誘導C57BL/6小鼠胸腺瘤模型的基礎上，將1.0×106個同系鼠MSCs經尾靜脈注入經射線照射的C57BL/6小鼠體內，在相同時間內觀察胸腺瘤的發生率，發現MSCs可降低輻射誘導C57BL/6小鼠胸腺瘤的發生。多年研究結果表明，電離輻射的靶目標是DNA，而DNA損傷及不正確修復是腫瘤發生的重要原因，MSCs是通過調控胸腺細胞微環境還是影響DNA損傷修復的信號傳導通路而降低胸腺瘤的發生，有待進一步研究。

1 孟繁凱，陳玉丙，李光民，等.骨髓間充質干細胞在腦缺血模型大鼠腦組織中的遷徙、定居及組織修復作用〔J〕.中國生物制品學雜志，2007;20(12)：890-6.

2 景元海，陳玉丙，聶長春，等.骨髓間充質干細胞對脊髓損傷治療作用及其機制的初步研究〔J〕.中國老年學雜志，2008;28(6)：547-8.

3 姚春麗，夏建新，陳玉丙.骨髓間充質干細胞對豚鼠皮膚光老化的修復作用〔J〕.中國生物制品學雜志，2008;21(4)：315-7.

4 滕春燕，于 庭，于艷輝，等.骨髓間充質干細胞對胰腺損傷模型大鼠血清生化指標的影響〔J〕.中國生物制品學雜志，2009;22(3)：252-5.

5 滕春燕，于 庭，劉愛忠，等.骨髓間充質干細胞誘導的胰島樣細胞治療大鼠胰腺損傷〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(3)：799-802.

6 滕春燕，于 庭，王春娥，等.骨髓間充質干細胞對大鼠胰腺損傷組織的修復作用〔J〕.中國生物制品學雜志，2009;22(4)：344-7.

7 牛鐵兵，陳玉丙，張立新.骨髓間充質干細胞移植對大鼠肝纖維化模型的修復作用〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2009;5(35)：874-6.

8 姚樹智，楊有庚，陳玉丙，等.骨髓間充質干細胞在脊髓損傷模型大鼠體內的轉化〔J〕.中國生物制品學雜志，2010;23(2)165-7.

9 Loebinger MR，Eddaoudi A，Davies D，et al.Mesenchymal stem cell delivery of TRAIL can eliminate metastatic cancer〔J〕.Cancer Res，2009;69：4134-42.

10 王洪艷，劉麗萍，龔守良，等.骨髓間充質干細胞對輻射誘發胸腺損傷修復中cyclin-D1和p53基因mRNA轉錄水平的影響〔J〕.中國生物制品學雜志，2011;24(2)：195-8.

11 Liu H，Kemeny DM，Heng BC，et al.The immunogenicity and immunomodulatory function of osteogenic cells differentiated from mesenchymal stem cells〔J〕.J Immunol，2006;176(5)：2864-71.

12 黃 玲，朱 偉，許文榮.間質干細胞與腫瘤微環境〔J〕.腫瘤防治研究，2010;37(6)：723-6.

13 Khakoo AY，Pati SA，Anderson SA，et al.Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma〔J〕.J Exp Med，2006;203(5)：1235-47.

14 Fürst G，Esch JS，Poll LW，et al.Portal vein embolization and autologous CD133+bone marrow stem cells for liver regeneration：Initial experience〔J〕.Radiology，2007;243(1)：171-9.

15 Hérodin F，Mayol JF，Mourcin F，et al.Which place for stem cell therapy in the treatment of acute radiation syndrome folia〔J〕.Stem Cells，2005;43(4)：223-7.