氯沙坦對腎間質纖維化大鼠腎組織ACE2 mRNA、TGF-β1 mRNA表達的影響

朱詩平 孫升云 馮偉峰 何 鈴 金 鑫 聶玲輝 (暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 50632)

腎間質纖維化是慢性腎臟病(CKD)的主要病理學基礎，阻抑腎間質纖維化的進展對防治CKD意義重大〔1〕。腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin-system，RAS)在腎間質纖維中發揮重要的作用〔2〕，其中血管緊系素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)能增加腎間質纖維化的關鍵因子轉化生長因子-β1(Transition Growth Factor-β1，TGF-β1)的表達〔3〕。近年來新發現的血管緊張素轉化酶2(Angiotensin-Converting Enzyme，ACE2)可直接水解AngⅡ生成Ang(1-7)，同時還可以水解AngⅠ為Ang-(1-9)，后者隨后被ACE降解為Ang(1-7)，Ang(1-7)在體內有著與AngⅡ相拮抗的生物學效應，因此ACE2被認為是一個防治CKD的新靶點〔4〕。本研究通過觀察氯沙坦對腺嘌呤致腎間質纖維化大鼠腎組織ACE2 mRNA、TGF-β1 mRNA表達水平的影響，探討氯沙坦除拮抗AngⅡ1型受體(AT1R)外可能的抗腎間質纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只，SPF級，體重(180±20)g。廣東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2008-0002。氯沙坦鉀片(科素亞、100 mg/片)，產品批號：09220，由杭州默沙東制藥有限公司生產。腺嘌呤(adenine，C5H5N5，FW：135.14)由廣州生產威佳科技有限公司提供，純度大于98%。ACE2、TGF-β1、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程有限公司合成。Trizol試劑盒由美國Invitrogen公司生產。逆轉錄反應試劑和PCR反應試劑(SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR Kit)由日本TaKaRa公司生產。9600PCR擴增儀(美國PE公司)、Chronmo4全自動熒光定量PCR儀(美國MJ Reaserch公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組 24只大鼠購入后，適應性喂養1 w。隨機選取8只為正常對照組，余下16只大鼠按參考文獻〔5〕予以2.5%腺嘌呤懸浮液按250 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃21 d，正常對照組用等量蒸餾水灌胃。采用目內眥取血，測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，證實腺嘌呤誘導大鼠腎性腎衰竭(CRF)模型造模成功后，再隨機分為模型組、氯沙坦組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 氯沙坦組按10 mg·kg-1·d-1給大鼠灌胃，用藥30 d，空白組、模型組予以等量蒸餾水灌胃。

1.2.3 標本采集與取材 實驗結束時，各組大鼠予以戊巴比妥鈉麻醉處死，用電子秤稱體重后剖檢，取鮮活腎組織，觀察腎臟形態，稱重。腎組織縱切，一部分放入4%多聚甲醛溶液固定，另一部分放入凍存管置于-80℃冰箱保存。

1.2.4 生化指標的檢測 留取血液、尿液送暨南大學附屬第一醫院檢驗中心，測定血清 Scr、BUN、24 h尿蛋白量(24 h MTP)等生化指標。

1.2.5 腎組織病理學觀察 常規石蠟切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。

1.2.6 Real Time PCR檢測 組織總RNA的提取按照Trizol說明書進行。配置逆轉錄體系：5xPrimeScriptTMBuffer 2 μl，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，RNase Free dH2O 4.5 μl，Total RNA 2 μl配置成10 μl的反應體系。充分混勻后然后放入PCR儀，37℃，15 min;85℃，5 s進行逆轉錄合成cDNA，以此為模板進行熒光定量PCR。根據基因庫設計引物序列如下：GAPDH：上游5'-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3'，下游：5'-CTG TGC CGT TGA ACT TGC-3'，產物大小 140 bp;ACE2：上游 5'-CAC CAA CAT TAC GGT GGT G-3'，下游：5'-GCC TTC AGT TGA CGC TTG-3'，產物大小 144 bp;TGF-β1：上游 5'-CAGGGCTTTCGCTTCAGT-3'，下游 5'-TGAGGAGCAGGAAGGGTC-3'，產物大小 139 bp。PCR 擴增條件：95℃、5 min，95℃、5 s，GAPDH 60℃、30 s(ACE2 57℃、30 s;TGF-β1 58℃、30 s)，72 ℃、15 s，40 個循環。以RNase Free dH2O代替cDNA為陰性對照組。采用2-△△CT法計算組間倍數。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件，數據資料以s表示，組間均數比較采用t檢驗、單因素方差分析。

2 結果

2.1 氯沙坦對腎間質纖維化大鼠Scr、BUN、24 h MTP、腎臟指數的影響 模型組大鼠的Scr、BUN和24 h MTP與正常組比較明顯升高(P＜0.01)，說明模型復制成功。氯沙坦組大鼠與模型組比較各指標有好轉，Scr、BUN和24 h MTP水平顯著下降(P＜0.01)。模型組大鼠與正常組比較，腎臟指數明顯升高(P＜0.01)，證實模型大鼠腎臟明顯腫大;氯沙坦組與模型組比較腎臟指數明顯下降(P＜0.05)。說明氯沙坦具有保護腎功能的作用。見表1。

表1 各組Scr、BUN、24 h MTP、腎臟指數比較( s，n=8)

表1 各組Scr、BUN、24 h MTP、腎臟指數比較( s，n=8)

與正常組比較：1)P ＜0.01;與模型組比較：2)P ＜0.05，3)P ＜0.01

組別 Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)24 hMTP(mg/d)腎臟指數(‰)正常組 19.38±1.41 4.06±1.48 181.25±56.63 4.86±0.26模型組 110.50±19.871)19.76±5.721)1015.10±207.601)14.18±3.401)氯沙坦組 38.13±7.733) 11.82±2.453)444.25±84.593)11.38±2.252)

2.2 氯沙坦對腎間質纖維化大鼠腎臟病理變化的影響 肉眼觀察腎組織，正常組腎臟呈蠶豆樣，形態規整，顏色為紅褐色，質地堅實，體積正常無腫大，有光澤。模型組和氯沙坦組大鼠的腎臟體積均呈現不同程度增大，尤其模型組腎臟增大最為明顯，呈“大白腎”外觀，腎臟表面可見大量白色顆粒密集分布，質地堅實。

HE染色光鏡下觀察：正常組大鼠的腎小球、腎小管、腎間質結構正常。模型組可見大量的腎小管上皮細胞凋亡、壞死、脫落或空泡樣變性，腎小管高度擴張，有不同程度的萎縮、硬化甚至壞死，被纖維組織代替;腎小管內、腎間質內有大量金黃色的嘌呤代謝產物結晶沉積。氯沙坦組也可見小管擴張、萎縮，間質纖維化，腎間質內有少量金黃色的嘌呤代謝產物結晶，伴有淋巴細胞浸潤，但纖維化程度輕于模型組。見圖1。

2.3 氯沙坦對腎間質纖維化大鼠腎組織ACE2 mRNA表達的影響 模型組大鼠腎組織ACE2 mRNA表達水平與正常組比較顯著減少(P＜0.01)，僅為正常組的0.20倍。經治療后，氯沙坦組ACE2 mRNA表達水平顯著增加(P＜0.01)，較模型組上升了2.34倍。見表2。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理改變(HE，×100)

表2 各組ACE2 mRNA表達水平比較( s，n=8)

表2 各組ACE2 mRNA表達水平比較( s，n=8)

與正常組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.05;下表同

組別 CTAvg.ACE2 CTAvg.GAPDH △CT 2-△△CT 26.65±1.79 21.22±0.78 5.28±1.07 -模型組 26.00±0.57 18.63±0.70 7.38±0.58 0.26±0.131)氯沙坦組 27.34±1.35 20.79±0.46 6.55±1.27 2.34±1.392)正常組

2.4 氯沙坦對腎間質纖維化大鼠腎組織TGF-β1 mRNA的影響 模型組TGF-β1 mRNA的表達水平較正常組上升了5.92倍(P＜0.01)。經治療后，氯沙坦組TGF-β1 mRNA表達水平較模型組顯著減少(P＜0.01)，減少幅度達到43%。見表3。

表3 各組TGF-β1 mRNA表達水平比較( s，n=8)

表3 各組TGF-β1 mRNA表達水平比較( s，n=8)

組別 CTAvg.TGF-β1 CTAvg.GAPDH △CT 2-△△CT 27.97±0.34 21.08±1.04 6.89±0.77 -模型組 23.80±0.70 19.41±1.23 4.39±0.59 5.92±1.861)氯沙坦組 27.07±0.74 21.50±0.79 5.43±0.66 0.57±0.292)正常組

3 討論

近來的流行病學調查表明，CKD的患病率、病死率都在逐年上升，在老年群體中患病率更高。在美國，成人CKD患者數已經達2 600萬，其中65歲以上的老年CKD患者占CKD住院總人數的61.4%，每年因尿毒癥死亡者約為8.5萬〔6，7〕。我國CKD患病率約為10%，其中北京地區40歲以上人群CKD患病率約為18%，每年因尿毒癥死亡者約為45萬〔8〕。因此，CKD成為影響老年群體健康的主要疾病之一。

腎間質纖維化是CKD的主要病理學基礎，阻抑腎間質纖維化的進展對防治CKD意義重大。AngⅡ的受體主要有AT1和AT2，在腎臟組織中主要為AT1受體，通過與AT1受體結合而導致尿蛋白的產生;增加細胞外基質(ECM)的合成，并減少ECM的降解，致ECM堆積;刺激細胞增殖，凋亡;增加炎癥細胞的浸潤，多方面共同促進腎間質纖維化的進展〔9〕。AngⅡ可以通過蛋白激酶(ERK)、C-Jun N端激酶(JUK)信號途徑上調TGF-β1的表達，TGF-β1是強烈的促纖維化因子，參與了腎小管間質病變及纖維化進展的各個環節，活化TGF-β1可使細胞活性增強、細胞外基質蛋白合成增多，并抑制基質的降解，促進了纖維化的形成。AngⅡ還可上調TGF-β1受體的表達，增強TGF-β1 作用的敏感性〔10〕。

ACE2是最近研究發現的一種與人類ACE同源的羧肽酶〔11，12〕，它的生理功能是可以直接水解 AngⅡ為 Ang(1-7)，同時ACE2可以水解AngⅠ為Ang(1-9)，后者隨后被ACE降解為Ang(1-7);而且 ACE2催化 AngⅡ的活性是 AngⅠ的400倍〔13〕。Ang(1-7)具體有拮抗 AngⅡ的生理作用〔14〕，可能是由AngⅠ(1-7)誘導AT1受體下調引起的〔15〕。而ACE2的生理作用可以減弱ACE/AngⅡ/AT1的作用，同時增強ACE2/Ang(1-7)/Mas的作用，而發揮抗腎間質纖維化的作用。因此，ACE2更適合作為治療腎間質纖維化的作用靶點。

TGF-β1是目前認為的致腎間質纖維化的重要因子。TGF-β1可刺激成纖維細胞增生，啟動腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉化(EMT)，增加ECM蛋白的合成，包括蛋白多糖膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ及纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN);減少基質金屬蛋白酶(MMPs)表達及增加組織金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的合成，增加促纖溶酶原激活物抑制物(PAI)的表達，減少ECM的降解;增強細胞表面的ECM受體-整合素的表達，使細胞與基質黏附增強，多方面共同促使ECM沉積，導致腎間質纖維化。

氯沙坦劑量依賴性地增加兩腎一夾高血壓大鼠ACE2 mRNA和蛋白質的表達，可劑量依賴性地顯著降低血壓，減少大鼠主動脈管壁厚度〔16〕。本實驗提示氯沙坦抗腎間質纖維化的作用，不僅通過競爭性的結合AT1R，減弱了AngⅡ的生理作用，而且通過上調ACE2 mRNA表達抑制TGF-β1 mRNA的表達，起到抗腎間質纖維化的作用。對于氯沙坦上調ACE2 mRNA的作用機制仍不清楚。目前合理的假說是由于氯沙坦負反饋引起了AngⅡ增加，由于Ang受體拮抗劑(ARB)減少了AngⅡ與其主要受體AT1R的結合，引起血漿和局部游離AngⅡ含量升高，為ACE2提供了更多的底物，可通過反饋途徑增加ACE2的表達。同時ARB也增加機體中Ang(1-7)的含量，并認為增加Ang(1-7)的ARB部分治療效應的實施者。

本實驗說明氯沙坦除了拮抗AT1R之外，同時上調ACE2的表達，可能直接水解AngⅡ，生成 Ang(1-7)，而對RAS起到了一個整體的調節。隨著對RAS中新成員的認識，氯沙坦對RAS整體影響的作用機制，仍有待進一步研究。

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