原發性肝癌組織中螺桿菌感染狀況分析

楊吉利 季尚瑋 張永貴 李紅艷 王江濱 (吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 130033)

目前認為原發性肝癌最常見的病因為HBV和HCV感染，其次還與黃曲霉素、酒精、自身免疫等因素有關。但是盡管存在同樣的致癌因素，其臨床表現及預后也相差甚遠。因此，除與上述致癌因素的致病強度及宿主免疫狀況等因素密切相關外，是否還存在其他協同致病因素，如細菌感染等，一直是人們關注的焦點。自1982年Warren和Marshall首次發現幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)以來，臨床及實驗研究已證實Hp感染與多種胃腸外疾病密切相關〔1～6〕。國外學者在人類慢性肝病患者的肝組織及膽管組織中均發現了螺桿菌菌屬DNA，證實了螺桿菌參與人類肝膽系統疾病的發生〔7，8〕。本實驗室也先后在慢性肝病組織中擴增出螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因〔9〕。本文旨在進一步探討螺桿菌與原發性肝癌的關系及螺桿菌在人類肝癌中的發病機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選擇2008年1月至2011年10月吉林大學中日聯誼醫院及吉林省腫瘤醫院手術切除及肝穿刺活檢確診為原發性肝癌的患者36例，男29例，女7例，年齡36～79〔平均(59±13.2)〕歲。按病因分類，合并病毒性感染27例 ，合并酒精性肝炎5例，病因不明肝癌4例。對照組為同期住院的性別和年齡相匹配的肝臟外傷患者29例，所有患者除外慢性病毒性肝炎、肝硬化、嗜酒、藥物及自身免疫性疾病及代謝性疾病等因素。兩組病例半年內均未接受過抗生素治療。

1.2 肝組織取材 4塊肝組織均來自彩超引導下肝臟穿刺活檢或手術切除所得，其中1塊-80℃低溫保存，用于螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因擴增;2塊置于10%甲醛液中固定，用于病理組織學檢查;1塊保存于含30%甘油及5%小牛血清的布氏肉湯中-80℃保存，行螺桿菌的分離培養及鑒定。

1.3 肝癌組織螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因檢測

1.3.1 肝臟組織DNA提取 肝臟組織DNA提取采用3S柱式提取法。試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3.2 PCR擴增 PCR反應總體系為 50 μl，包括 Taq DNA聚合酶 2.5 U(0.5 μl)，10 × Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2，3.6 μl(終濃度為 1.8 mmol/L)，10 mmol/L dNTPs 1 μl(終濃度為 200 μmol/L)，25 μmol/L 引 物 各 1 μl(終 濃 度 分 別 為0.5 mmol/L)，DNA模板1 μl。螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因引物序列及PCR反應條件見表1。

表1 螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因引物序列及PCR反應條件

1.3.3 電泳分析 分別取螺桿菌菌屬特異性16 S rRNA基因PCR擴增產物10 μl加入2 μl溴酚藍混合均勻，點樣于含0.2%溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V直流電電泳30 min，然后紫外燈下觀察結果，并應用紫外成像系統照相。

1.4 統計學方法 樣本均數的比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗。應用SPSS11.0軟件完成。

2 結果

2.1 原發性肝癌患者肝組織中螺桿菌菌屬16S rRNA基因分析 對36例原發性肝癌患者的肝組織DNA采用螺桿菌16S rRNA基因通用引物進行巢式 PCR擴增。結果有 23例(63.9%)肝癌患者的肝組織檢測到螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因，而正常肝組織中僅3例(10.3%)為陽性。兩組比較有顯著差異(χ2=19.18，P＜0.001)。見圖1。

圖1 原發性肝癌組織與正常肝組織中螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因擴增電泳圖

2.2 原發性肝癌組織中螺桿菌感染狀況與肝臟基礎疾病的相關性分析 為探討螺桿菌感染與原發性肝癌基礎疾病的關系，將肝癌組分為合并病毒性肝炎組、合并酒精性肝炎組、其他組。結果顯示：在27例合并病毒感染者中，螺桿菌特異性16S rRNA基因陽性者17例(62.9%);在5例合并酒精性肝炎患者中，螺桿菌16S rRNA基因陽性者4例(80.0%);其他原因者2例(50.0%)。各組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 肝癌組織螺桿菌的分離培養及鑒定 為了證實原發性肝癌患者的肝組織中是否有活體螺桿菌菌體的存在，將36例原發性肝癌患者的肝組織進行螺桿菌分離培養3～10 d，結果均未發現可疑菌落生長。

3 討論

1992年Fox等〔10〕發現H.hepaticus與 A/J Cr小鼠的慢性肝損傷，甚至肝癌的發生發展有著密切關系。其后，生物學界開始展開了關于螺桿菌屬與人類慢性肝病之間關系的研究。隨著對螺桿菌菌屬研究的不斷深入，科學家們相繼在人類原發性肝癌組織、丙型肝炎、肝硬化肝組織及膽管癌組織和膽汁中發現了螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因。Pellicano等〔7〕對23例HCV相關性肝癌患者和6例胃腸道惡性腫瘤肝轉移患者的肝臟組織進行螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因檢測，結果顯示23例肝癌組織中有17例(85%)發現螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因，而6例肝轉移癌組織中僅有2例發現螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因。Rocha等〔8〕對109例丙型肝炎后肝硬化患者的肝組織進行螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因檢測，發現伴有肝癌組、不伴肝癌的肝硬化組螺桿菌16S rRNA基因陽性率分別為68.0%、61.3%，而單純慢性肝炎組和對照組螺桿菌16S rRNA基因陽性率分別為4.2%、3.5%。提示螺桿菌感染可導致臟臟結構變化，可能是HCV相關性慢性肝病的協同危險因素〔11〕。日本學者通過血清抗H.hepaticus抗體檢測提示，在乙肝、丙肝、肝硬化患者中H.hepaticus感染率明顯高于健康人群〔6〕。還有學者在膽石癥患者的膽汁中檢測肝螺桿菌陽性率41%，在膽囊炎合并胃癌的患者中肝螺桿菌陽性率36%，明顯高于無膽道疾病的患者〔12〕。本實驗室也先后在慢性病毒性肝炎、肝硬化患者的肝組織中擴增出螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因。

本結果提示螺桿菌在原發性肝癌的發生、發展過程中扮演重要角色，肝炎病毒、酒精等伴隨因素并不是影響螺桿菌感染肝癌患者的主要因素。綜上所述，本研究表明螺桿菌感染可能是原發性肝癌重要生物學因素之一。但具體菌種尚需進一步鑒定，而且關于肝螺桿菌誘發肝細胞癌的發生機制還不太清楚，這些均有待進一步研究。

1 Sakai T，Ognra Y，Narita J，et al.Simultaneous early adenocarcinoma and mucosa-associated lymphoid tissue(MALT)lymphoma of the stomach associated with Helicobacter pylori infection〔J〕.Gastric Cancer，2003;8：191-6.

2 高 文，胡伏蓮.幽門螺桿菌與胃腸外疾病〔J〕.中華醫學雜志，2001;81(23)：1470-2.

3 Suzuk T，Matsushima M，Masui A，et al.Effect of Helicobacter pylori eradication in patients with chronic：diopathic thrombocytopurpura a randomized controlled trial〔J〕.Am J Gastroenterrol，2005;100(6)：1265-70.

4 Roussos A，Tsimpoukas F，Anastasakou E，et al.Helicobacter pylori seroprevalence in patients with chronic bronchitis〔J〕.J Gastroenterol，2002;37(5)：332-5.

5 黃 燕，范學工.幽門螺桿菌感染與胃腸外疾病〔J〕.中國實用內科，2003;23(10)：628-30.

6 Murakami K，Takahashi R，Ono M，et al.Serodiagnosis of Helicobacter hepaticus infection in patients with liver and gastrointestinal diseases：western blot analysis and ELISA using a highly specific monoclonal antibody for H.hepaticus antigen〔J〕.J Gastroenterol，2011;46(9)：1120-6.

7 Pellicano R，Mazzaferro V，Grigioni WF，et al.Helicobacter species sequences in liver samples from patients with and without hepatocellular carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10：598-601.

8 Rocha M，Avenaud P，Ménard A，et al.Association of Helicobacter species with hepatitis C cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma〔J〕.Gut，2005;54：396-401.

9 季尚瑋，王江濱，張永貴.慢性乙型肝炎患者肝組織中螺桿菌菌屬特異性16SrRNA基因及HP特異性基因分析〔J〕.肝臟，2009;14(6)：449-53.

10 Fox JG，Dewhirst FE，Tully JG，et al.Helicobacter hepaticus sp.Nov.a microaerophilic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice〔J〕.J Clin Microbiol，1994;32：1238-45.

11 Whary MT，Fox JG.Natural and experimental Helicobacter infections〔J〕.Comp Med，2004;54：128-58.

12 Hamada T，Yokota K，Ayada K，et al.Detection of helicobacter hepaticus in human bile samples of patients with biliary disease〔J〕.Helicobacter，2009;14(9)：545-51.