慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子HMGB1的變化及臨床意義

代靈靈 程 哲 康 燕 李 芳

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室，河南 鄭州450052)

目前針對慢性阻塞性肺疾病(COPD)炎癥因子的研究主要集中在早期炎癥因子，如 IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α 和 IFN-γ〔1，2〕，而國內(nèi)外關(guān)于晚期炎癥因子與COPD炎癥關(guān)系的研究較少。高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)是在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中廣泛存在的DNA結(jié)合蛋白，近年眾多研究證明HMGB1具有晚期炎癥介質(zhì)作用，可促進(jìn)多種晚期炎癥因子釋放，是一個具有顯著促炎效應(yīng)的細(xì)胞因子。本研究通過比較COPD患者和健康人群誘導(dǎo)痰中HMGB1的表達(dá)水平，以及COPD不同嚴(yán)重程度及COPD治療前后HMGB1表達(dá)水平，探討HMGB1與COPD嚴(yán)重程度的相關(guān)性及在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 COPD組：收集2011年1月至6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科病房和門診就診的COPD患者58例，男40例，女18例，平均年齡(63.5±12)歲，對照組：同期健康體檢者30例，男20例，女10例，平均年齡(62.2±13.1)歲。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)重程度分級、穩(wěn)定期和急性加重期的定義均參考GOLD2010，其中穩(wěn)定期28例，急性加重期30例;輕度8例，中度8例，重度16例，極重度26例。納入對象排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺部活動性結(jié)核，肺膿腫，肺部腫瘤，肺部間質(zhì)纖維化，急性肺損傷，近期進(jìn)行過機(jī)械通氣治療;②有腫瘤、腸道炎癥性疾病，肝炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，燒傷，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，類風(fēng)濕疾病，休克等;③其他可以影響HMGB1水平變化的疾病。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均獲知情同意。

1.2 方法

1.2.1 指標(biāo)檢測方法 對所有受試者入組時進(jìn)行肺功能檢查及誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞計數(shù)、上清液HMGB1水平檢測;所有入組COPD患者治療前及治療4 w后行肺功能檢查及誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞計數(shù)、上清液HMGB1水平檢測。誘導(dǎo)痰技術(shù)參照文獻(xiàn)〔3〕推薦的步驟進(jìn)行，痰標(biāo)本的處理依照文獻(xiàn)〔4〕的方法進(jìn)行，痰涂片中以鱗狀上皮細(xì)胞＞10個/低倍視野，且中性粒細(xì)胞＞25個/低倍視野為合格痰標(biāo)本。選取少量新鮮痰標(biāo)本進(jìn)行涂片，風(fēng)干后進(jìn)行瑞氏染色，進(jìn)一步行誘導(dǎo)痰細(xì)胞計數(shù)和分類，計算中性粒細(xì)胞百分比。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測上清液中HMGB1水平，檢測方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。肺功能儀(德國JAEGER公司)記錄第1秒用力呼氣容積(FEV1)，占預(yù)計值的百分比(FEV%)，第1秒用力呼氣容積占用力肺活量的比(FEV1/FVC)。

1.2.2 治療方法 COPD患者均給予規(guī)范的ICS/LABA(布地奈德福莫特羅160/4.5 μg)聯(lián)合治療，2次/d。每周電話隨訪1次，如果癥狀變化或控制不良，隨時調(diào)整治療方案。

2 結(jié)果

2.1 治療前后COPD組誘導(dǎo)痰中中性粒細(xì)胞百分比和HMGB1水平 治療前COPD組患者誘導(dǎo)痰中中性粒細(xì)胞百分比、HMGB1水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。急性加重期誘導(dǎo)痰中 HMGB1的含量〔(565.2±18.7)ng/ml〕高于穩(wěn)定期〔(410.2 ±17.4)ng/ml〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。治療前COPD患者HMGB1的表達(dá)及中性粒細(xì)胞水平在不同嚴(yán)重程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表1，表2。治療后誘導(dǎo)痰中的HMGB1的含量及中性粒細(xì)胞水平均較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 治療前后兩組誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞、HMGB1水平比較(s)

表1 治療前后兩組誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞、HMGB1水平比較(s)

組別 n 中性粒細(xì)胞(%)HMGB1(ng/ml)30 25.1±4.3 43.3±1.5 COPD組 58 治療前 65.3±10.7 490.4±16.9治療后 420±8.5 405.1±12.8 t值 25.0 200.7 P值對照組0.000 0.000

2.2 COPD治療前后誘導(dǎo)痰中HMGB1水平和FEV1%、FEV1/FVC、誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞百分比相關(guān)性分析 治療前后誘導(dǎo)痰中HMGB1濃度和FEV1%呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.632、-0.710，P＜0.01)，與 FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.592，-0.613，P＜0.01)，與誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)(r值分別為0.368、0.412，P ＜0.01)。

表2 治療前不同嚴(yán)重程度的COPD患者誘導(dǎo)痰中HMGB1水平比較(s)

表2 治療前不同嚴(yán)重程度的COPD患者誘導(dǎo)痰中HMGB1水平比較(s)

與重度與極重度比較：1)P＜0.05

嚴(yán)重程度分級 n 中性粒細(xì)胞(%)輕度 8 321.6±10.41)0.000中度 8 458.8±9.01)重度 16 497.3±14.1極重度 26 547.8±10.5 F值 562.5 P值

3 討論

HMGB1是一種新近發(fā)現(xiàn)的晚期炎癥介質(zhì)，在膿毒癥〔5〕、急性肺損傷〔6〕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔7〕、支氣管哮喘〔8〕等炎癥狀態(tài)下高表達(dá)，能激發(fā)“壞死誘導(dǎo)炎癥”，可促進(jìn)炎性細(xì)胞活化和促進(jìn)多種炎癥因子釋放，且在動物實驗中表明HMGB1拮抗劑能在多種炎癥疾病中起到保護(hù)作用，因此被認(rèn)為是多種炎癥疾病治療的潛在靶點〔9〕。COPD是一種氣道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，HMGB1在COPD發(fā)生中的作用國內(nèi)外研究較少。因此本研究對COPD患者誘導(dǎo)痰HMGB1進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示HMGB1在COPD誘導(dǎo)痰中水平較健康對照組明顯升高，且在不同分期、不同嚴(yán)重程度存在差異，提示 HGMB1在COPD患者中存在異常。提示HMGB1不僅是COPD的晚期炎癥介質(zhì)，而且影響到肺功能，并且抗炎治療可以降低其水平，提示可以將HMGB1作為治療COPD的新靶點。

國外有學(xué)者對COPD患者肺泡灌洗液中HMGB1表達(dá)水平進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示COPD患者肺泡灌洗液中HMGB1表達(dá)水平升高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)〔10〕，與本研究結(jié)果一致，進(jìn)一步提示HGMB1參與了COPD疾病的進(jìn)展，誘導(dǎo)痰中HMGB1水平可以作為監(jiān)測COPD嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

既往研究表明在COPD誘導(dǎo)痰中，中性粒細(xì)胞比例升高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)〔11〕，本研究證實了這一點，提示中性粒細(xì)胞是COPD中HMGB1釋放的重要來源，而既往研究提示提示單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞是COPD患者HMGBl的重要來源〔9〕，這提示COPD中HGMB1存在多種來源，不同來源的HGMB1在COPD發(fā)生、發(fā)展過程中的地位尚需進(jìn)一步研究。

1 Moermans C，Heinen V，Nquyen M，et al.Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Cytokine，2011;56(2)：298-304.

2 Switalla S，Lauenstein L，Prenzler F，et al.Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol，2010：Epub ahead of print.

3 Paggiaro PL，Chanez P，Holz O，et al.Sputum induction〔J〕.Eur Respir J Suppl，2002;37：3S-8S.

4 Pavord ID，Pizzichini MM，Pizzichini E，et al.The use of induced sputum to investigate airway inflammation〔J〕.Thorax，1997;52：498-501.

5 Wang H，Bloom O，Zhang M，et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice〔J〕.Science，1999;285(5425)：248-51.

6 Abraham E，Arcaoli J，Carmody A，et al.HMG-1 as a mediator of lung inflammation〔J〕.J Immunol，2000;165(6)：2950-4.

7 Taniguchi N，Kawahara K，Yone K，et al.High mobility group box Chromosomal protein 1 plays a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis as a novel cytokine〔J〕.Arthritis Rheum，2003;48(4)：971-81.

8 程 哲，代靈靈，曹德飛，等.支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰中HMGB 1和RAGE水平的變化及臨床意義〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2011;91(22)：1538-42.

9 Wang H，Li W，Goldstein R，et al.HMGB 1 as a potential therapeutic Targe〔J〕.Novartis Found Symp，2007;280：73-85.

10 Ferhani N，Letuve S，Kozhich A，et al.Expression of high-mobility group box1 and of receptor for advanced glycation end Products in chronic obstructive pulmonary〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2010;181(9)：917-27.

11 Beeh KM，Beier J，Kornmann O，et al.Long-term repeatability of induced sputum cells and inflammatory markers in stable，moderately severe COPD〔J〕.Chest，2003;123(3)：778-83.