HPLC測定腎康口服液中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量

秦靜海，曹站霞

(河南中醫學院第一附屬醫院，河南鄭州 450000)

腎康口服液為我院院內制劑，由大黃、白花蛇舌草、牡蠣、川芎等組成，具有蕩滌濁毒、清熱活瘀的功效。大黃［1］為其君藥，主要活性成分為大黃酸、大黃素、大黃酚等。目前對腎康口服液的質量控制主要依據薄層色譜法來進行定性監測，可該法不能很好地反映其內在真實質量。HPLC能對藥品的主要有效成分進行定量監測，是當前的藥品質量控制的通用方法。本文擬建立腎康口服液的HPLC方法，為進一步提高腎康口服液質量的穩定性，實現確保臨床療效奠定基礎。

1 藥品、試劑與儀器

腎康口服液，10 mL/支，制劑號為豫藥制字Z04010431，批號 111026，111210，120217;實驗藥材均取自河南中醫學院第一附屬醫院中藥房，經河南中醫學院第一附屬醫院藥學部陳天朝主任藥師鑒定為正品。大黃酸(批號0757-200206)、大黃素(批號110756-200110)、大黃酚對照品(批號110796-200716)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司產品;色譜柱為Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，0．5 μm)，安捷倫科技有限公司產品;Sartorius CP225D電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司提供。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

采用 Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，5μm)色譜柱，以甲醇-0．1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫(見表1)，體積流量1．0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，進樣量20 μL。理論板數按峰計算應不低于3000。

表1 梯度洗脫程序

2．2 對照品溶液的制備

分別精密稱取大黃酸、大黃素、大黃酚對照品1．05，0．15，0．13 mg 置于 25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即分別得到42．016 mg/L的大黃酸溶液、5．968 mg/L 大黃素溶液和5．200 mg/L大黃酚溶液。

2．3 供試品溶液的制備

精密量取(取前搖勻)各樣品2．0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。用0．45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2．4 陰性對照液的制備及干擾試驗

按處方取去除大黃的藥材，按樣品工藝同法制備，制得陰性對照樣品，再按供試品溶液的制備方法操作，制成陰性對照溶液。將對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各進樣20 μL，按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果見圖1。結果表明：供試品色譜中，與對照品色譜相應位置上，具有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照色譜中無干擾。

圖1 腎康口服液對照品及供試品色譜圖

2．5 線性關系考察

精密吸取大黃酸、大黃素和大黃酚對照品的混合液 0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，分別置于5 mL容量瓶中;加甲醇稀釋至刻度;再精密吸取上述對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀中。以對照品質量濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y建立三者的標準曲線。結果：大黃酸標準曲線方程為Y=3 ×106X-5 019．9，r=0．999 8(n=6);大黃素標準曲線方程為 Y=3 ×106X+1 436．9，r=0．999 8(n=6);大黃酚標準曲線方程為Y=5×106X+2 260．8，r=0．999 8(n=6)。表明：大黃酸、大黃素、大黃酚濃度分別在 4．201 6 ～42．016 0 mg/L、0．596 8 ～5．968 0 mg/L、0．52 ～5．20 mg/L 范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2．6 精密度試驗

取大黃酸、大黃素、大黃酚混合對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，大黃酸、大黃素、大黃酚RSD 值分別為0．44%，1．31%，1．35%。結果表明：精密度良好。

2．7 重復性試驗

取同一供試品溶液，按供試品溶液制備方法平行處理6份，依法測定，大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積 RSD 值分別為 0．30%，2．26%，2．12%。結果表明：重復性良好。

2．8 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，48 h 各進樣 1 次，大黃酸、大黃素、大黃酚RSD 值分別為1．21%，2．43%，2．59%。結果表明：供試品溶液中大黃酸、大黃素、大黃酚含量在48 h內穩定性較好。

2．9 加樣回收率試驗

取已知大黃酸、大黃素、大黃酚含量的樣品溶液6份，分別精密加入對照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按樣品測定方法測大黃酸、大黃素、大黃酚含量。結果：大黃酸平均回收率為102．59%，RSD值為1．06%;大黃素平均回收率為99．90%，RSD值為2．85%;大黃酚平均回收率為100．41%，RSD 值為1．89%。見表2～4。

表3 大黃素加樣回收率試驗結果

表4 大黃酚加樣回收率試驗結果

2．10 樣品含量測定

按上述方法，制備供試品溶液，測定3批腎康口服液中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量，結果見表5。

表5 3批樣品中大黃酸、大黃素和大黃酚含量測定結果 mg·L-1

3 討論

本實驗最初采用2010版《中藥藥典》一部大黃項下甲醇-磷酸水溶液等度洗脫的方法，但色譜峰有重疊、拖尾的現象，不能得到良好的分離效果。經過試驗，采用梯度洗脫的方法，達到了良好的分離。本實驗通過對腎康口服液HPLC的方法學考察得出：本試驗條件用于腎康口服液中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量測定，方法穩定、可靠，可作為控制本品質量的有效方法。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：一部［M］．北京：中國醫藥科技出版社，2010：22．

［2］高學敏．中藥學［M］．北京：中國中醫藥出版社，2007：158．