牛結核病綜合防控措施

熊學凱 陳穎鈺 郭愛珍 *

1.華中農業大學動物醫學院，武漢 430070；2.華中農業大學動物科技學院，武漢 430070；3.華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室，武漢 430070

牛結核病主要是由牛分枝桿菌引起的人畜共患的一種慢性消耗性傳染病，OIE將其列為需上報疾病，在我國屬于二類動物疫病。該病以組織器官的結核結節性肉芽腫和干酪樣、鈣化的壞死病灶為特征，導致病牛漸進性消瘦、咳嗽、生產能力下降、衰竭直至死亡。牛結核病在世界各國均有發生，在我國仍然是最常見的多發性疾病之一。目前，全球范圍內每年約有5000萬頭牛感染結核病，造成的直接經濟損失達30多億美元[1]。另據報道，世界上結核病患者中約有15%是通過飲用了結核病牛所產的牛奶而患病的。牛結核病的流行不僅嚴重影響到養牛業，尤其是奶牛業的健康持續發展，而且由于交叉感染使人類的健康受到威脅。因此，世界各國均采用檢疫和撲殺政策控制牛結核病，但是牛分枝桿菌宿主廣泛，防控方法單一，凈化相當困難。我國牛結核病的流行狀況尚不清楚，但總體呈上升和蔓延趨勢，在牛結核病的綜合防控和凈化方面面臨著巨大挑戰。

1 牛分枝桿菌的病原學特征

牛結核病主要是由分枝桿菌屬牛分枝桿菌引起，另外還有結核分枝桿菌和禽分枝桿菌。其中，結核分枝桿菌主要感染人，也可引起牛結核病；禽分枝桿菌主要感染家禽，也可感染牛、豬和人[2]。

牛分枝桿菌為棍棒狀，較粗短，不產生芽孢和莢膜，也不能運動，屬于革蘭氏陽性菌，用一般染色法較難著色，常用萋-尼氏抗酸染色法染色。該菌為專性需氧菌，最適生長溫度為37.5℃，最適pH值范圍為5.9～6.9，在培養基上生長非常緩慢。在含有牛血清或雞蛋的固體培養基上3周左右才開始生長，呈粟粒大的圓形細小菌落，稍干燥呈鱗屑狀。

牛分枝桿菌富含類脂和蠟脂，對外界環境的抵抗力較強，對干燥、濕冷、腐敗的耐受力很強。在干燥的痰液中可存活10個月，在病變組織和塵埃中可存活2～7個月，在水中可存活5個月，在糞便和土壤中可存活6～7個月，在乳中可存活3個月，在污水中可存活11～15個月。對熱很敏感，60℃30min可將其殺死，在直射陽光下數小時可死亡，在100℃沸水中立即死亡，因此經巴氏消毒的乳制品已無危險。無機酸、有機酸、堿性物質和季銨鹽類消毒劑對該菌無效，但在5%來蘇兒、3%～5%甲醛液、70%酒精和10%漂白粉溶液中均可被殺死[3]。

2 牛結核病的流行病學

該病主要侵害牛，特別是奶牛，其次是水牛、黃牛，各年齡的牛均可感染。此外，由于牛分枝桿菌的宿主范圍比較廣泛，幾乎可以感染大部分的溫血脊椎動物，如人、豬、鹿、大象、猴、狒狒、獅子及禽類。

病牛和病人，特別是開放型患者是主要傳染源，其糞尿、乳汁、生殖道分泌物、唾液、鼻液、痰液等均能排放病原菌，污染飼料、食物、飲水、空氣和環境而散播傳染[4]。家畜和人主要通過呼吸道和消化道感染，吸入被污染的飛沫或媒介是傳播本病的最主要方式，也可以通過交配傳播。犢牛主要是由于吮吸帶病原菌的牛奶而感染，成年牛多因與患病牛、病人直接接觸而感染。

該病多呈散發或地方性流行，無明顯的季節性和地區性。飼養管理不當，如廄舍擁擠、通風不良、潮濕、陽光不足、衛生條件差及日糧營養不足、缺乏運動、使役過重等均可誘發本病。

3 牛結核病的臨床癥狀

牛結核病的潛伏期長短不一，一般為10～45d，長者可達數月乃至數年，通常呈慢性經過。因病變器官不同，癥狀不一，臨床中以肺結核、乳房結核及腸結核較為常見，還可見淋巴結核、生殖器結核、腦結核、胸膜結核等。

3.1 肺結核

以長期頑固地干咳為特征，且以清晨最為明顯。病牛初期易疲勞，食欲、反芻無明顯變化，常出現短而干的咳嗽，當病牛起立、運動和吸入冷空氣時易發咳嗽。隨病情發展，咳嗽加重、頻繁，并轉為濕咳，咳嗽聲音較弱，且咳嗽時表現痛苦，呼吸次數增加，嚴重時發生氣短。鼻液呈黏性、膿性，灰黃色，呼出氣有腐臭味。胸部聽診常有啰音和摩擦音，叩診有半濁音或清濁音。病牛逐漸消瘦、貧血，肩前、股前、腹股溝、頜下、咽及頸淋巴結腫大，縱膈淋巴結腫大時可壓迫食道，引起慢性瘤胃臌氣。病情惡化時，病牛體溫升高至40℃以上，呈弛張熱或稽留熱，呼吸更加困難，最后可因心力衰竭而死亡。

3.2 乳房結核

病牛一般是乳房淋巴結腫大，繼而兩乳患病區發生局限性或彌散性硬結，硬結無熱無痛，表面凹凸不平。泌乳量逐漸下降，乳汁初期無明顯變化，嚴重時可變得稀薄如水。由于腫塊形成和乳腺萎縮，兩側乳房變得不對稱，乳頭變形、位置異常，導致泌乳停止。

3.3 腸結核

病牛呈現前胃弛緩，食欲下降，消化不良，迅速消瘦，全身乏力，頑固性腹瀉，糞便呈稀粥狀，帶有黏液和膿汁。直腸檢查時，腹膜粗糙不光滑，腸系膜淋巴結腫大。

3.4 淋巴結核

可見于結核病的各個病型，常見頜下、咽、頸、肩前、股前及腹股溝等部位，淋巴結腫大突出于體表，無熱痛。咽后淋巴結腫大時，壓迫咽喉，呼吸音多粗厲、響亮；肩前和股后淋巴結腫大時，可引發前后肢跛行。

3.5 生殖器結核

病母牛從陰道中流出透明的黃白色黏液，混有血液和干酪樣絮片或膿液；情期紊亂，發情次數增加，但不易受孕；妊娠牛易流產。病公牛附睪腫大，發硬，陰莖前部出現結節、糜爛。

3.6 腦結核

病牛多呈神經癥狀，如驚恐不安、興奮、肌肉震顫、站立不穩、步態蹣跚、頭頸僵硬、眼肌麻痹等，病程后期可見痙攣、昏迷、呼吸與心率失常。

4 牛結核病的病理變化

剖檢可見多種組織器官形成肉芽腫或粟粒樣結節，以肺和淋巴結最為多見。肺部出現針尖至雞蛋大小的黃白色堅硬結節，切開時有砂礫感，結節中心有干酪樣壞死或鈣化灶，有的軟化、溶解形成空洞。胸膜和腹膜表面形成一些粟粒至豌豆大小、半透明的灰白色、較堅硬的結節，形似珍珠狀，又稱為“珍珠病”。腸結核發生于小腸或盲腸，腸黏膜可見大小不等的結核結節或局灶性潰瘍，潰瘍周圍呈堤狀，底部堅硬并覆有干酪樣物。乳房結核多發生于進行性病例，剖開可見有大小不等病灶，內含有干酪樣物質，還可見到急性滲出性乳房炎的病理變化。

5 牛結核病的檢測方法

5.1 傳統分離培養法

嚴格按照《結核病診斷細菌學檢驗規程》，對采取的組織病料或痰液進行一定的處理，將收集到的分枝桿菌接種于酸性羅氏培養基上，約1個月后可見黃色粗糙米粒狀菌落即判定為牛分枝桿菌或結核分枝桿菌。此種方法主要依賴于分枝桿菌的生物學特性和培養特征，能獲得細菌菌落進行定量，可以檢測到1×102～1×103個菌/mL，實驗成本低廉，但是檢測耗時較長（1～2周或更長），培養過程中容易污染，總體檢出率也高，還需要運用其他方法進一步驗證菌株特異性[5]。

5.2 結核菌素試驗

結核菌素試驗（PPD）是目前國內外應用最多的牛分枝桿菌檢測方法，也是OIE推薦的牛結核病診斷方法，具有靈敏、簡單和價廉的特點。結核菌素是從結核菌中分離得到的菌體蛋白，并經飽和硫酸銨或三氯醋酸粗提與純化制成的診斷制品。如果機體感染過結核病，免疫B細胞會對結核分枝桿菌產生記憶，當再次用結合菌素去刺激機體，機體會產生超敏反應性炎癥，導致皮膚增厚。其結果判斷標準為：增加4mm為陽性，2～4mm為可疑，2mm以下為陰性。PPD皮試的缺陷有：工作量和勞動強度大，檢測時間間隔較長，測量皮厚時存在人為誤差，結果判斷主觀性強，同時也存在一定非特異性反應。

5.3 IFN-γ體外釋放檢測法

IFN-γ體外釋放檢測是一種細胞免疫檢測方法，IFN-γ主要是由活化的T淋巴細胞及自然殺傷細胞產生，可以用PPD刺激被檢抗凝全血中的淋巴細胞24h，由于免疫細胞存在記憶性，如果是已致敏的免疫細胞就會產生大量的IFN-γ，通過檢測IFN-γ的數量變化，來間接檢測機體是否感染了結核分枝桿菌。此種方法靈敏度與特異性均較高，操作快速簡單，只需要較少的血液樣本[6]，可實現批量檢測。但是IFN-γ的產生依賴于記憶性免疫細胞，本身也缺乏一定特異性，采血后需在24h內進行刺激，只能檢測特定時期的感染情況，成本也較高。

5.4 抗體檢測法

由于抗體檢測法快速、簡便，可大批量檢測，便于實現自動化，具有很好的應用前景，目前的抗體檢測法有ELISA與膠體金試紙條2種。

ELISA檢測法通過將結核分枝桿菌的特異性抗原包被到固相載體上，對血清中的特定抗體進行定性和定量檢測，是一種間接檢測結核分枝桿菌的方法。此種方法由于ELISA試劑盒的普遍商品化而更加經濟實惠，樣本易得，實驗操作也簡單快捷，可以進行輔助性診斷。但是不同蛋白的特異性不一樣，檢測時敏感性和特異性存在一定的差異性。

膠體金試紙條是利用免疫學原理檢測牛結核抗體的一種簡單快速的方法，建立在膠體金顆粒的特異結構和特性上[7]。當膠體金顆粒上的特異性結核抗原與血清中的結核抗體結合，隨著層析效應與檢測線上能與抗體反應的抗原結合時，出現一條紅色的陽性檢測線，而當顆粒繼續移動到達質控線，結核抗原會與預先固定好的相應抗體結合而控制試紙條的質量。此方法也存在一定缺點，如試紙條受各種理化因素影響較大，要用特定的緩沖液稀釋，檢測的靈敏度易受影響等。

5.5 PCR和多重PCR檢測

PCR和多重PCR檢測技術是利用多聚酶鏈式反應直接檢測樣品中的結核分枝桿菌，相對免疫學的間接檢測方法則更具有檢測意義，已應用于各醫院的結核病診斷及各牛場的牛結核病檢測和流行病學調查中。當得到被檢樣品，如全血、奶樣、組織、痰液等標本后，進行樣本的初處理，去除脂類和一些雜質，然后集菌并加裂解液或直接煮沸裂解，獲得的結核菌DNA樣本就可以作為PCR的模板。PCR是針對結核分枝桿菌特異性的基因設計引物，而多重PCR則是針對多個特異基因設計引物，進行多聚酶鏈式反應擴增，得到特異性的目的條帶，從而特異性檢測出結核分枝桿菌。多重PCR相對PCR而言更方便快捷、經濟實惠、工作量小，一次反應可以檢測多個目的基因，但是引物設計要更復雜，對設備和人員的要求也更高[8]。

6 牛結核病的綜合防控措施

6.1 預防為主，積極研發新技術

隨著人類對結核病防控認識的進一步深入，發現根除動物結核病其實是根除人類結核病的必要前提。由于動物飼養量及流動量大幅增加、野生動物的活動及國際貿易的日益頻繁，牛結核病的流行率不斷上升，以預防為主的疫苗免疫越來越受關注。目前，結核疫苗是醫學領域研究的熱點之一[9]，國內外已開展一系列結核病新型疫苗的研究，而且借鑒人類結核疫苗的開發經驗，動物疫苗研制的后發優勢將比較明顯。鑒于卡介苗（BCG）的高安全性，已將BCG用于牛結核病的預防以檢驗對牛和其它野生動物的保護力，同時通過各種途徑來提高BCG原有的保護力和尋找BCG的替代物。

除了結核疫苗外，需積極研發、利用新型技術和手段來加強牛結核病的預防。例如，可將先進的電腦系統利用到整個牛結核病的防疫體制，利用地理信息系統（GIS）或地球定位系統（GPS）進行牛結核病流行病學的監測與可追溯[10]，能隨時關注全國的檢疫動態。

6.2 加強檢疫，防止疫病傳入

無結核病的健康牛群應每年春、秋各進行1次結核菌素變態反應檢疫，以便及時發現病牛，清除傳染源，凈化牛群。在引進牛時，先進行產地檢疫，確認為陰性方可引進，運回后隔離觀察1個月以上再進行檢疫，確認健康后方可混群飼養。

盡量減少牛群接觸病原菌的機會，牛分枝桿菌的主要宿主是牛，但獾、白尾鹿等野生動物宿主也是感染牛的重要傳染源。因此，牛舍內不能同時飼養其它牲畜及禽類，防止可能隱匿分枝桿菌。同時，對已嚴重污染的場地實行關閉、停產，防止因消毒不徹底或在原場地生長的各種帶菌動物對牛群造成感染[11]。

6.3 隔離撲殺，凈化污染牛群

對檢出的陽性牛原則上應立即撲殺，也可以隔離飼養，并定期進行檢疫；發現開放性結核病病牛時，應立即撲殺，尸體要進行深埋或焚燒等無害化處理。優秀的高產奶牛或種牛患病，可用鏈霉素、異煙肼利福平等藥物進行治療。對疑似病牛應隔離飼養，1個月后進行復查，如仍有疑似反應，要繼續隔離飼養，再經25～30d進行復查，如還有疑似反應，可按陽性牛進行處理。

對污染牛群，每年進行4次以上檢疫，檢出的陽性牛及可疑牛要立即分群為陽性牛群與可疑牛群。剔除陽性牛及可疑牛后的牛群，應間隔30～45d檢疫1次，連檢3次均為陰性者，認為是健康牛的可放入假定健康牛群。假定健康牛群為曾經檢出結核陽性牛，且每年檢疫陽性率在3%以下的牛群，需每年進行2次以上定期檢疫。當無陽性牛出現時，再經過1.0～1.5a連續3次檢疫，結果均為陰性時，可確定為健康畜群[12]。

6.4 堅持消毒，培養健康犢牛

每年定期（2～4次）對整個牛舍及周圍環境進行全面消毒，消滅傳染源與傳播媒介。飼養場或牛舍進出口處要設置消毒池，內置有效消毒劑，如3%～5%來蘇/L溶液或20%石灰乳等，對進出的車輛、飼養人員、獸醫人員要嚴格消毒。牛舍、運動場每月消毒1次，飼養用具每10d消毒1次；金屬設施、設備可采取火焰、熏蒸等方式消毒，飼料、墊料可采取深埋發酵處理或焚燒處理；產房每周進行1次大消毒，分娩室在臨產牛生產前及分娩后各進行1次消毒。

病牛專門設置分娩室，分娩前消毒乳房及后軀，所產犢牛立即與母牛隔離，人工喂健康牛的初乳5d，之后喂健康牛乳或消毒乳。犢牛應在6個月隔離飼養中分別于20～30、100～120和160～180d進行3次檢疫，均為陰性反應的牛可轉入假定健康牛群；陽性犢牛全部淘汰；可疑犢牛需在30～45d后復檢。

6.5 加強管理，提高防疫意識

飼養管理人員要定期體檢，取得健康證后方可上崗，嚴禁互相串崗，非工作人員不得隨意出入牛場，避免人畜互相傳染。

檢疫部門應加強牛場疫病防治工作的指導和監督，建立健全奶牛防疫制度，全面實行奶牛健康證和戶口臺帳管理，所有奶牛都應登記造冊，及時記錄奶牛存欄和調運狀況。對健康奶牛發給奶牛結核病檢疫合格證明，憑證銷售牛奶或轉讓健康牛，以保障奶牛業的健康發展。同時，定期開展牛結核病的監測、檢疫，督促牛場及時撲殺病牛，不留隱患，指導并監督消毒和防疫措施的實施。

6.6 制定有效的防控和凈化計劃

由于宿主范圍廣泛、感染與發病過程緩慢、潛伏感染普遍、幾乎無現代化的控制手段（無疫苗、無藥物、無快速高通量檢測方法），牛結核病的控制和根除是一個循序漸進的漫長過程[13]，需要制定有效的防控和凈化計劃，并長期保持信心和熱情。

加強對牛結核病及野生動物結核病的流行病學調查研究，實施高覆蓋率采樣，整合相關調查結果，徹底摸清病原流行及分布特點，為牛結核病的防控和凈化打下堅實的基礎。學習發達國家控制牛結核病的重要措施和成功經驗，加大牛群流動監管力度，減少區域之間的無序流動現象，建立完整的可追溯體系，實現區域化管理。同時，健全更新牛結核病的相應政策法規，提高公眾對牛結核病防控意義的認識，各級政府、各級官員、專家、獸醫防疫人員、養殖業主和消費者等多方面力量相互配合，為有效控制牛結核病提供保障。

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