骨膜瓣復合異體骨移植修復大段骨缺損

張大偉 田清業 劉光軍 劉雪濤 王謙 楊磊

高能量損傷、腫瘤切除及先天畸形都可引起四肢長骨的大段缺損。大段骨缺損常用自體骨和異體骨移植治療。無論是自體骨移植還是異體骨移植，大段移植骨中部爬行替代緩慢，極易出現骨溶解吸收、骨折等并發癥。較理想的方法是自體骨瓣移植，但自體骨瓣因骨量有限，臨床應用受到限制。近年來有報道使用帶血管骨膜瓣復合異體骨移植的手術方法，該類方法中較經典的是帶血管腓骨瓣復合大段異體骨移植，具有操作簡單、副損傷小、骨膜瓣來源廣泛等優點[1]，但王劍利等[2]報道的6例臨床應用中，2例出現一端不愈合、1例并發感染、1例并發骨折，并認為導致該問題的原因為骨膜瓣復合的位置及異體骨血管化受限。因此，我們將帶薄層皮質骨的骨膜瓣嵌入開窗的異體骨，為臨床長段骨缺損的治療提供參考和資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康正常成年家兔60只，體質量2.5～3.5 Kg，雌雄不限，由解放軍89醫院實驗中心提供。隨機分為3組（n=20），即實驗組、對照組及空白對照組。

1.2 主要實驗儀器與試劑

計算機控制溫度速率儀（美國MVE公司）、深低溫冰箱（美國Dupont Suva公司）、口腔電動磨鉆（荷蘭Philips公司）、計算機X線成像(CR)（美國GE公司）、2500E型切片機（德國LEICA公司）、VEGF免疫組化試劑盒（美國RD生物工程公司）、EDTA（臺州市晶皓化工有限公司）、TBS（臺州市晶皓化工有限公司）。

1.3 大段同種異體骨的制作

健康正常成體家兔10只，無菌條件下截取雙側脛骨干3.0 cm，去除軟組織，刮除骨髓，鹽水反復沖洗干凈，浸泡于慶大霉素鹽水中，用雙層血漿袋保存。計算機控制溫度速率儀按2℃/min的降溫速率將骨組織的環境溫度降至-80℃，再置入深低溫冰箱中保存。共制備異體骨段標本20個備用。

1.4 手術方法

動物禁食水12 h，左后肢脫毛，3%戊巴比妥鈉按30 mg/Kg的劑量靜脈滴入，麻醉生效后，常規消毒鋪無菌單，于小腿中段作一約3 cm的縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織，分離并保護脛前血管及其分支，切除1 cm長脛骨，制成脛骨骨缺損模型。將已制備的長管狀同種異體骨按兩步解凍法解凍，截成1 cm長骨段備用。

1.4.1 實驗組

切取1/2周徑骨膜及其附帶的薄層骨皮質，保留骨膜表面的薄層肌袖。以口腔磨鉆于大段異體骨中部開一骨窗，面積約5 mm×5 mm、深約1 mm（圖1、2），大小與骨膜瓣相近，深達骨松質，將異體骨嵌入骨缺損處，直徑2.0 mm的克氏針髓內固定，然后將骨膜瓣嵌入骨窗，絲線捆綁。

1.4.2 對照組

切取1/2周徑骨膜及其表面的肌袖，異體骨直接嵌入骨缺損處，直徑2.0 mm的克氏針髓內固定，骨膜瓣包裹覆蓋，絲線捆綁。

1.4.3 空白對照組

將骨膜及表面的肌袖徹底剝離后去除，異體骨直接嵌入骨缺損處，直徑2.0 mm的克氏針髓內固定。關閉切口，無菌敷料包扎固定。

自手術日起,所有動物每日2萬單位的慶大霉素肌肉注射，連續一周。隔天換藥。

1.5 觀察指標

實驗動物術后依次于4、8、12、16周處死并觀察以下指標。

1.5.1 大體觀察

解剖出異體骨標本，肉眼觀察新生骨痂數量，骨膜瓣及骨組織血運及骨膜瓣與異體骨貼附結合情況。

1.5.2 X線攝片及骨痂半定量分析

術后立即、術后的4，8，12，16周分別截取動物左后肢行X線的檢測，每次每組隨機抽取2只，仔細觀察不同時期內的骨缺損愈合情況，骨痂的形成情況。并將CR圖像存入計算機，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各組骨痂區相同面積進行分析，計算出骨痂灰度密度積分。

1.5.3 光鏡下組織學觀察和免疫組織化學觀察

分別取術后4、8、12、16周的骨組織及附帶的骨膜等周圍軟組織，制備10 μm石蠟切片，蘇木精伊紅(HE)染色觀察。

每組任取10張切片，常規脫蠟至水，經抗原修復后，應用SABC法對作用于血管內皮細胞的特異性因子VEGF進行原位標記。光鏡下觀察新生小血管的分布，隨機選取4個視野，觀察并計數VEGF表達陽性細胞。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 三組移植骨段大體觀察

①實驗組：4周時已形成纖維包裹，移植骨與宿主骨之間有大量纖維連結，骨膜瓣與移植骨結合緊密，以骨刀將其剝離后可見較多橫行血管肉芽組織進入移植骨；8周時，兩結合處連接緊密，骨膜瓣與移植骨融為一體；12周時移植骨周圍纖維囊硬化，有大量骨痂形成；16周時已形成新的皮質骨結構，髓腔融合。②對照組：4周時異體骨塊形成纖維包裹，骨膜瓣與移植骨貼附松散，偶見小的液化腔；8周時骨膜瓣可從移植骨表面剝離，有少量橫行血管肉芽進入移植骨，移植骨皮質凹凸不平；12周時移植骨周圍纖維囊硬化，有大量骨痂形成；16周時形成新的皮質骨結構，髓腔部分融合。③空白對照組：周時移植骨無顯著變化，移植骨與宿主骨之間有少量纖維連結；8周時形成纖維包裹，移植骨與宿主骨之間形成纖維連結；12周時兩結合處仍以纖維連結為主；16周時纖維包裹硬化，有少量骨痂。

2.2 X線攝片及骨痂半定量分析

①實驗組：4周時骨斷端變得稍模糊，可見少量骨痂包繞異體骨，移植骨的形狀和密度無明顯的改變；8周、12周時接觸面變得模糊，移植物輪廓亦變得模糊，密度稍變低，骨痂包裹移植物，嵌入組皮質骨開窗處有大量骨痂形成；16周時移植骨兩端已與宿主連接，骨密度接近宿主自身骨，開窗處皮質骨連續性大部恢復（圖3）。②對照組：4周時少量骨痂包繞異體骨，移植骨的形狀和密度無明顯的改變；8周、12周時骨端接觸面變得模糊，移植物輪廓亦變得模糊，密度稍變低；16周時異體骨周圍有大量骨痂包繞（圖4）。③空白對照組：4周時遠、近端結合部骨折線清晰，未見外骨痂生長；8周、12周時移植異體骨段骨密度仍較高，遠、近端結合部骨折線變得稍模糊，僅見少量外層骨痂生長；16周時移植骨周圍有骨痂形成，但其密度和數量均低于實驗組，骨端骨折線變得模糊，部分內固定克氏針斷裂（圖5）。經圖像分析系統計算骨痂灰度密度積分，實驗組新生骨痂數量和質量優于對照組及空白對照組（表1），差別有統計學意義。

表1 不同時間點骨痂灰度積分Table 1 The average value of callus grey level in different time points

2.3 組織學觀察

2.3.1 HE染色

①實驗組：4周時異體骨哈弗管內均為無結構狀，異體骨與宿主骨結合處可見有少量纖維肉芽組織連接，開窗處可見大量纖維肉芽組織侵入松質骨骨小梁；8周時異體骨內哈弗管擴大，有大量新生血管自開窗處長入并向兩斷端爬行、伴新骨生成，并有少量新生骨小梁突向髓腔內，新生血管數量及新生骨量較多；12周時新生骨單位和殘存骨單位并存，新生骨單位哈佛氏管內可見血管和活的細胞成分，周邊骨旋渦排列有規律，其內可見大量成骨及破骨細胞；16周時開窗處已形成新的密質結構，有大量成熟的骨小梁，髓腔基本融合，異體骨內部見多數成熟骨單位，偶見殘存骨單位，骨單位哈佛氏管內可見血管和活的細胞（圖6）。②對照組：4周時異體骨哈弗管內均為無結構狀，異體骨與宿主骨結合處可見有少量纖維肉芽組織連接，異體骨邊緣皮質有少量不規則的吸收陷窩；8周時表面吸收腔擴大，與宿主哈弗管相通，有少量新生血管長入并伴新骨生成；12周時靠近外表面和髓腔側切片內亦可見新生骨單位，中間部位切片仍見大量壞死殘存的骨單位；16周時僅在自體骨-異體骨連接處見較多成熟骨小梁，連接處髓腔基本融合，異體骨段外周新形成一薄層骨密質，異體骨密質表面仍可見大量破骨細胞吸收陷窩及成骨細胞，異體骨內部可見新生骨單位與殘存骨單位并存（圖7）。③空白對照組：4周時異體骨哈弗管內均為無結構狀；8周時異體骨邊緣皮質有少量不規則的吸收陷窩；12周時哈佛氏管擴大，其內未見細胞成分，周邊骨旋渦排列紊亂，中央空虛，無細胞結構；16周時哈佛氏管擴大，其內見新生血管自自體骨-異體骨連接處向內部爬行，新生骨單位量較少（圖8）。

2.3.2 免疫組化染色

VEGF陽性效應產物呈棕黃色顆粒狀分布于成骨細胞、成軟骨細胞及纖維細胞的細胞包漿。我們按照以下標準記錄評分結果和陽性細胞數：①陰性（-）：細胞內無著色，評分：0 分；②弱陽性（+）：細胞染成淡黃色，陽性細胞<25%，評分：1分；③陽性（++）：細胞染成黃色，陽性細胞數25%～50%，評分：2分；④強陽性（+++）：細胞染成棕黃色。陽性細胞數>50%，評分：3分。結果顯示：①正常情況下（即空白對照組）在移植早期VEGF的表達僅出現在外周軟組織內，移植中期在移植骨外表面及內部均有少量表達，移植晚期在外周骨痂及皮質骨表達較少、松質骨部分表達較多；②實驗組移植骨在整個爬行替代過程中VEGF表達水平均較高；早期即在移植骨表面及內部有較高水平的表達，中期及晚期皮質骨內持續高水平表達；晚期外周骨痂形成后，皮質骨及松質骨內表達水平仍較高。③對照組移植骨VEGF表達水平較嵌入組為低，皮質骨內表達低下，待外周骨痂形成后更進一步降低（表2-4）。

表2 實驗組不同時間點、不同區域VEGF的表達Table 2 The VEGF expression of experimental group in different time points and different regions

表3 包裹組不同時間點、不同區域VEGF的表達Table 3 The VEGF expression of control group in different time points and different regions

表4 空白對照組不同時間點、不同區域VEGF的表達Table 4 The VEGF expression of blank group in different time points and different regions

圖1 異體骨開窗面積Fig.1 Bone window area of allograft bone

圖2 異體骨開窗深度Fig.2 Bone window depth of allograft bone

圖3 實驗組術后4周X線片Fig.3 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in experimental group

圖4 對照組術后4周X線片Fig.4 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in control group

圖5 空白對照組術后4周X線片Fig.5 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in blank group

圖6 實驗組組織學觀察見新生骨皮質（HE，400×）Fig.6 New bone cortex formation was observed in experimental group by HE staining(HE,400×)

圖7 對照組組織學觀察見殘存骨單位（HE，400×）Fig.7 Remaining bone unit was observed in control group by HE staining(HE,400×)

圖8 空白對照組組織學觀察見髓腔內壞死（HE，400×）Fig.8 Marrow necrosis was observed in blank group by HE staining (HE,400×)

3 討論

帶血管骨膜瓣復合異體骨移植是近年來顯微外科技術在異體骨移植領域的新進展，諸多動物實驗【3】證明了帶血管骨膜瓣具有改善受區骨床血供、促進大段異體骨血管化、加速異體骨爬行替代速度的優點，但該方法在臨床實際應用中的效果卻欠佳，尤其是與經典的帶血管腓骨瓣復合移植相比。我們認為導致該問題的原因包括：①直接以骨膜瓣包裹異體骨段，骨膜瓣容易因為手術操作中周圍軟組織嵌入、骨缺損斷端截骨產生的血腫、移植早期急性排斥反應導致的炎性滲出等原因致使骨膜瓣自異體骨表面浮起、貼附不緊密，必然會影響骨膜瓣作用的發揮。②帶血管骨膜瓣不僅可以提供豐富的血供，更重要的是它具有很強的成骨作用。組織學研究【4】表明骨膜分淺表的纖維層、中間的血管性未分化層和深面的生發層。纖維層中有Sharpy纖維穿入骨質，起固定骨膜和韌帶的作用。生發層緊貼骨表面，血管和細胞豐富，有成骨能力，又稱成骨層。由于Sharpy纖維將骨膜與骨緊緊相連，從骨上掀起骨膜時，骨膜的生發層會受到損傷，不可避免地會響骨膜的成骨能力。因此單純以骨膜覆蓋而不附帶薄層皮質骨，有影響骨膜瓣成骨活性的可能。③皮質骨結構緊密，其爬行替代過程表現為第一階段暴露緣被破骨細胞吸收，形成“陷窩”或“網眼”，哈弗管轉變為小的髓腔，肉芽組織長入，原始間充質細胞充填大的腔隙；第二階段髓腔達到預想的大小，吸收停止，成骨細胞充填腔隙同時伴有活性的骨樣組織沉積。因此，直接與皮質骨相接觸的骨膜瓣雖然可以提供充足確實的局部血供、大量的活性骨細胞、細胞因子等有利于異體骨愈合的因素，但如果無法募集及分化出大量破骨細胞、單核及多核巨噬細胞[5]，必然會導致爬行替代的不完全。④實驗中可見，在中晚期隨著對照組骨膜瓣下新骨的沉積、異體骨表面骨痂的形成，異體骨內部的血管化速度、新骨生成量進一步下降，即由于新骨的生成，阻礙了骨膜內血管向異體骨深部長入、限制了內部破骨細胞的量，導致表層皮質骨被替代，而深層皮質骨、松質骨的替代受到限制。這是直接包裹法的又一缺點。

針對上述問題，我們在實驗中進行了相應改進。①經開窗嵌入，骨膜瓣與大段異體骨中部結合緊密，確實可靠的結合是骨膜瓣發揮作用的前提條件。在實驗中可見，骨膜瓣附帶的薄層皮質骨早期即可與異體骨段形成纖維連結，隨著骨質沉積，徹底與異體骨融為一體。帶血管骨膜瓣所提供的豐富的血供及其生發層募集、分化的各種活性骨細胞可通過此薄層皮質骨進入異體骨段深部，事實上成為了骨缺損兩斷端之外的第三個爬行替代的“活化中心”，其作用類似于帶血管腓骨瓣復合異體骨移植中的自體骨，且在爬行替代結束后成為“異體骨”皮質的一部分。②切取骨膜瓣時，用銳利骨鑿鑿取薄層皮質骨并同時掀起骨膜。一方面，能完整獲得范圍較大的骨膜；另一方面，既不損傷骨膜又保留了皮質骨的活力，兩者在受區共同作用，充分發揮骨膜瓣的成骨潛能，加速異體骨的爬行替代。③將骨膜瓣由直接包裹改為嵌入，改變了大段異體骨中部爬行替代的次序。深部的松質骨首先活化，有新生血管及肉芽組織長入，繼而在松質骨及髓腔內形成大量骨痂，而皮質骨則由外骨痂經改造塑形后重新形成。松質骨是具有高度疏松多孔的、開放的小梁狀結構，而皮質骨中的孔隙主要為致密板層骨的哈佛管及福克曼管系統，其孔隙率、孔徑及孔隙間的交通率均明顯低于松質骨，在移植早期出現的局部創傷、血腫形成及纖維機化過程中兩者并無差異，而其后的毛細血管長入則大為不同，松質骨移植后后數小時內血管化已開始，至大約2周時已達到完全血管化，而皮質骨的完全血管化需大約2個月時間，此時的松質骨已完全被新生骨和骨樣組織所填滿[6，7]。因此這一改變從整體上加速了爬行替代的速度，此外還避免了后期表面骨痂的形成對深部異體骨替代的阻礙。因此在實驗中嵌入法與包裹法相比在血管化速度、新骨生成及完全愈合后生物力學強度三方面均表現出了一定的優勢。

針對今后的臨床應用，我們認為本方法在使用中應注意：①切取皮質骨-骨膜瓣時應仔細游離并保護其營養血管，注意兩者的解剖聯系，勿使骨膜與皮質骨分離。②皮質骨-骨膜瓣切取的位置以股骨內側髁區域為首選，即形成以膝降動脈為蒂的骨膜瓣[8]。此處位置表淺、血管變異較少、皮質骨菲薄、可取面積較大（平均6 cm×3 cm），并且可附帶相應皮瓣修復皮膚缺損[9]。③由于大段異體骨中部皮質骨開窗，必然會導致開窗側的應力集中，有導致異體骨醫源性骨折的可能性。因此采用髓內固定、避免偏心固定，并于移植早期輔助以適當外固定是必要的。隨著移植后期大段移植骨改造塑形結束，“異體骨”強度得以恢復，該問題自然會得以解決。

以帶血管薄層皮質骨-骨膜瓣嵌入開窗的異體骨修復大段骨缺損的手術方法優于以骨膜瓣直接包裹異體骨的方法，縮短骨缺損修復的時間，提高修復的程度，在臨床大段骨缺損的治療中有廣闊的應用前景。

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