CD204陰性人脂肪來源細胞體外成軟骨潛能的初步研究

丁金萍 孫恒赟 陳謹君 張文杰 劉偉 曹誼林 周廣東

軟骨組織工程技術出現至今，關于種子細胞的研究從未間斷，并且始終是一個核心問題。軟骨細胞是構建軟骨最理想的種子細胞，但軟骨細胞來源有限，取材創傷大，大量擴增后又極易發生老化與去分化[1]。骨髓基質干細胞是研究較多的成體干細胞，但由于骨髓穿刺給患者帶來一定痛苦，而且細胞獲得量小，在臨床應用中受到一定的限制。因此，如何獲得來源廣泛、數量充足、功能良好，且具有軟骨分化潛能的細胞，是解決軟骨組織工程種子細胞問題的關鍵。自Zuk等[2]成功分離培養出具有多向分化潛能的脂肪組織來源干細胞（ADSCs）以來，將其作為軟骨組織工程種子細胞的研究越來越多。但通常所稱的ADSCs是一群混雜細胞群[2]，其中一些脂肪前體細胞、內皮細胞、成纖維細胞等會影響ADSCs構建軟骨的成功率和均質性。我們的前期研究通過單細胞克隆培養及軟骨定向誘導技術，將具有克隆形成能力的ADSCs分為具有和不具有軟骨分化潛能的兩類克隆群，再結合基因芯片技術篩選出與軟骨分化潛能相關的表面膜蛋白；以此表面標志為基礎，進一步結合細胞分選，以及體外軟骨定向誘導技術，有可能找到適合組織工程軟骨構建的ADSCs的新標志。本研究就是基于基因芯片初篩所得的CD204（巨噬細胞清道夫受體)在兩類不同克隆群差異表達的結果，探討以CD204作為細胞分選標志，研究分選后細胞體外成軟骨能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

10 cm培養皿，離心管，0.22 μm針孔過濾器（Falcon公司）；低糖及高糖 DMEM培養液，MesenPRO RSTMMedium，青鏈霉素原液，0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；0.25%氯霉素（上海交通大學附屬第九人民醫院自制）；Ⅰ型膠原酶（Serva公司）；地塞米松、ITS+(Sigma公司)；Isotype鼠 IgG2B-PE 抗體， 鼠抗人 CD204-PE 抗體，TGF-β3，IGF，BMP-6(R&D公司)；鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（Dako公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司）；流式細胞分選儀（Beckman-coulter公司）。

1.2 脂肪來源干細胞的分離及原代培養

脂肪組織來源于18～35歲要求行抽脂術的健康成年人2例，供體無傳染病及內分泌疾病，平均抽脂吸出物800 mL。

分離抽脂術后抽吸物的脂質部分約800 mL，用0.25%氯霉素和生理鹽水沖洗，用0.075%Ⅰ型膠原酶與脂質成分等體積置于50 mL離心管，37℃恒溫搖床反復震蕩消化40min。1500 r/min離心5min，去上清，低糖DMEM培養液重懸后100 μm金屬濾器過濾，1500 r/min離心5min，吸除上清液，沉淀重懸后按2×104cells/cm2密度接種于培養皿內，置于CO2培養箱內培養16 h后進行流式細胞分選。

1.3 流式細胞分選

標本制備：原代細胞貼壁16 h后，用0.25%胰酶消化，單細胞濾器過濾，離心棄上清，PBS重懸，分blank組、isotype-PE組和 CD204-PE組，4℃孵育40min，PBS洗滌 3次，加 500μL PBS待上機。分選后的細胞用MesenPRO RS培養液按2×104cells/cm2密度接種于培養皿內，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱內培養。

1.4 體外定向成脂、成骨分化

成脂誘導分化：取CD204+和CD204-的第2代細胞，胰蛋白酶消化，調整細胞密度到3000 cells/cm2。48 h后更換成脂誘導液DMEM培養基（含10%胎牛血清，0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤，1 μM地塞米松，10 μM胰島素，200 μM吲哚美辛），完全培養基組作為陰性對照。每3天更換培養液，定向誘導分化10 d后，行油紅O染色，觀察誘導分化結果。

成骨誘導分化：分別取分選擴增后的第2代CD204+和CD204-細胞，胰蛋白酶消化，將細胞密度調整到 3000 cells/cm2。48 h后更換成骨誘導DMEM培養基（含10%胎牛血清，50 μg/mL維生素C，0.1 μM 地塞米松，10 μM β-磷酸甘油鈉）， 完全培養基組作為陰性對照。每3天更換培養液，定向誘導分化14 d后，行茜素紅染色，觀察誘導分化結果。

1.5 細胞pellet培養及成軟骨誘導

分別取CD204+和CD204-的第2代細胞，0.25%胰酶消化后，常規1500 r/min離心5min，MesenPRO RSTM培養液重懸后細胞計數，按0.5×106個細胞接種至15 mL離心管中，1080 r/min，37℃離心5min，即置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱內培養。

細胞pellet靜置培養3 d后，每個15 mL離心管底可見細胞形成球狀，此時即可更換成軟骨誘導液。成軟骨誘導液配方：高糖DMEM，1×ITS+，10 ng/mL TGF-β3， 10 ng/mL BMP-6， 50 ng/mL IGF-1， 0.1 μM地塞米松，50 μg/mL 維生素 C，40 μg/mL 脯氨酸。成軟骨誘導4周后，進行大體觀察和HE、Safranin O等組織學染色，以及Ⅱ型膠原免疫組化染色。

2 結果

2.1 分選后細胞形態學觀察

脂肪來源細胞貼壁16 h后經流式分選，分別獲得CD204+和CD204-兩類細胞。CD204-組細胞3～4h后開始貼壁生長，24h后逐漸伸展開來，細胞呈成纖維細胞樣，5 d后達到90%融合狀態，并呈極性生長。CD204+細胞6～8 h開始貼壁生長，1～2 d伸展開來，細胞呈成纖維細胞樣，7～10 d后達到90%融合狀態（圖 1）。

圖2 脂肪來源干細胞成脂、成骨誘導分化（刻度：100 μm）Fig.2 ADSCs differentiation toward adipose lineage and osteogenic lineage(bar:100 μm).

圖3 細胞pellet大體觀Fig.3 Gross view of cell pellet

2.2 脂肪來源干細胞成脂、成骨分化

成脂誘導分化：經流式分選后，兩組細胞形態類似成纖維細胞，長梭形，成脂誘導分化10 d后，細胞形態明顯改變，從長梭形逐漸變圓，油紅O染色陽性，且CD204+細胞具有更強的成脂潛能（圖2）。

成骨誘導分化：CD204+和CD204-細胞被成骨誘導分化14 d后，茜素紅染色示成骨細胞及鈣沉積被紅染，且CD204-細胞具有更強的成骨潛能（圖2）。

2.3 細胞pellet大體及組織學檢測

細胞pellet大體觀：可見CD204-組形成了具有瓷白色透明軟骨樣外觀的pellet，直徑約2 mm，觸之具有一定的彈性，而CD204+組外觀微黃，觸之柔軟，直徑約1 mm（圖3）。

組織學和組織化學檢測：HE染色可見CD204-pellet組形成明顯軟骨陷窩樣結構，內有細胞核，周圍有紫染的胞外基質沉積，而CD204+pellet未形成陷窩結構。Safranin O染色可見CD204-組具有軟骨特異性基質染色，提示細胞外基質中含有豐富的蛋白多糖沉積。Ⅱ型膠原免疫組化染色結果與HE相符（圖 4）。

圖4 pellet組織學檢測（標準：100 μm）Fig.4 Histological observation of cell pellets(bar:100 μm).

3 討論

脂肪來源干細胞（ADSCs）增殖能力強，具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉等組織多向分化的潛能，且細胞來源豐富，取材創傷小，是構建軟骨組織的良好的種子細胞。然而，ADSCs是一混雜細胞群[2-4]，包括脂肪前體細胞、成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等，會干擾組織工程化軟骨的構建。近年的研究顯示，脂肪來源細胞中具有成脂、成骨、成軟骨分化潛能細胞的比例存在很大差別，其中具有成軟骨潛能的干細胞所占比例很低[5]。蔣婷等[6]應用已知干細胞表面標志CD105進行流式分選，發現CD105+細胞比CD105-細胞具有更好的成軟骨潛能，但CD105+細胞構建的軟骨組織均質性仍然欠佳。因此，我們嘗試尋找與軟骨潛能密切相關的表面標志。

前期基因芯片結果提示，CD204是ADSCs中與成軟骨潛能關系較為密切的表面標志之一。本實驗首次應用CD204作為表面標志，對ADSCs中具有成軟骨潛能的細胞進行分離純化，并對其干細胞特性及成軟骨能力進行了初步探討。結果顯示，CD204-細胞比CD204+細胞具有更強的成軟骨能力。該結果提示我們，脂肪來源細胞中具有成軟骨潛能的干細胞主要存在于CD204-細胞中。但該結果與基因芯片分析結論大相徑庭，可能是因為單細胞克隆體外擴增過程中細胞表型和特性發生較大改變。同時，CD204-細胞pellet組大體觀和組織學結果顯示pellet大部分形成了軟骨樣組織，但仍有小部分呈纖維化，提示CD204-細胞并非是一個非常均質的細胞群體，需要開展進一步的相關研究。

CD204是A類巨噬細胞清道夫受體蛋白，能調節細胞黏附、吞噬并在參與脂質代謝、防御外界病原微生物入侵等各種生理和病理方面起重要作用[7-10]。CD204通常被認為是M2型巨噬細胞的標志，常被用來區分M2型和M1型巨噬細胞。而M2型巨噬細胞被公認為在纖維化的早期階段會釋放大量促炎癥因子和纖維調節因子，如TGF-β等，從而促進組織纖維化的發生[13]。將CD204缺失的老鼠暴露在二氧化硅的環境中，其炎癥反應低下，IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子產生減少，肺纖維化發生率下降[11－12]，這些現象提示CD204在炎癥的產生及纖維化的發生中有重要作用。另外，M2型巨噬細胞還與血管化過程和創傷修復過程密切相關[13,14]。同時，肥胖癥患者中，巨噬細胞分泌的炎癥因子（如TNF-α），能刺激脂肪細胞釋放更多的金屬基質蛋白酶，包括MMP1、MMP3、MMP9、MMP10、MMP12 和 MMP19 等[15]。 另有研究顯示，脂肪組織中的巨噬細胞是通過脂肪前體細胞轉變而來，在脂肪組織中的多少與年齡、性別和肥胖程度等有關[12]。

綜上所述，CD204在炎癥的發生及纖維化、血管化過程及創傷修復過程中有重要作用，這些可能是導致本實驗中CD204+細胞不能被誘導形成軟骨細胞的重要因素。通過流式分選去除約10%的CD204+細胞后，CD204-細胞誘導成軟骨細胞的效果明顯提高，且CD204-細胞pellet能被誘導成較均質的軟骨。然而，經過分選純化后的CD204-細胞中并不是所有細胞都具有成軟骨潛能。因此，要真正將這部分細胞用于特定組織的構建與缺損修復，還需要進一步深入研究。

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