顱縫早閉畸形的遺傳學(xué)研究進(jìn)展

楊嫻嫻 綜述 穆雄錚 審校

顱縫早閉癥是常見的先天性顱頜面畸形，其發(fā)病率居常見顱面發(fā)育畸形發(fā)病率的第二位（約為1/2500，僅次于唇腭裂畸形）。由于顱縫提早發(fā)生骨性閉合可導(dǎo)致顱腔狹小，形成三角頭、舟狀頭、斜頭等復(fù)雜的顱頜面畸形綜合征，不僅造成顱面骨畸形，而且可導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高、視力減退甚至失明，嚴(yán)重者可使腦發(fā)育受阻，影響患兒的智力發(fā)育[1]，或因危險的并發(fā)癥而危及生命。目前尚無理想的治療方法能夠完全予以修復(fù)，對患者及其家庭的社會生活和心理健康產(chǎn)生了諸多負(fù)面影響。所以，對該疾病遺傳機制的研究具有重要意義。本文就先天性顱縫早閉畸形的遺傳學(xué)研究現(xiàn)狀及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 顱骨發(fā)育、顱縫閉合的理論

顱骨由腦顱（顱頂）和面顱（顱底）兩部分構(gòu)成，顱骨發(fā)育約開始于胚胎第23天，顱頂骨與顱底骨的發(fā)育表現(xiàn)為兩種不同的方式。顱底骨起源于外胚層神經(jīng)嵴，由間充質(zhì)主要以軟骨內(nèi)成骨的方式發(fā)育形成，與長骨類似。顱頂骨起源于中胚層，由腦組織周圍的間充質(zhì)以膜內(nèi)成骨的方式發(fā)育而成。在胎兒期和嬰兒期，顱頂骨骨化尚未完成，各扁平骨之間存在致密結(jié)締組織構(gòu)成的膜性連接，包括囟門以及顱縫。后囟出生后不久即封閉，前囟在出生后1.5～2年間消失，顱縫的閉合時間則較遲。

國際上關(guān)于顱骨發(fā)育、顱縫閉合的理論認(rèn)為[2]，來自發(fā)育大腦的信號是顱骨形成的關(guān)鍵因素，硬腦膜分泌的可溶性生長因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在傳送從大腦到腦顱的信號方面起非常重要的作用，大腦、硬腦膜和發(fā)育的顱骨、顱縫之間復(fù)雜的相互作用，最終引起顱縫的閉合。一旦顱縫周圍的生化環(huán)境變化及基因遺傳的改變干擾了此復(fù)雜的生長發(fā)育體系，便可導(dǎo)致顱縫的異常閉合。

顱頂骨的發(fā)育由多能間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的增殖、分化而形成，具體為間充質(zhì)干細(xì)胞—骨祖細(xì)胞—前成骨細(xì)胞—成骨細(xì)胞的分化過程，歷經(jīng)成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞凋亡四個階段，最終形成新骨。顱蓋的形成最初來源于部分間充質(zhì)的濃集，稱初級骨化中心。隨著顱縫兩側(cè)顱骨間充質(zhì)細(xì)胞增殖、向成骨細(xì)胞分化，顱骨成骨前緣不斷向顱縫側(cè)靠攏，顱縫逐漸閉合[3]。纖維顱縫組織如同顱骨間靈活的關(guān)節(jié)連接，調(diào)節(jié)頭顱的發(fā)育和外形結(jié)構(gòu)，正常的顱縫閉合過程依賴顱骨成骨前緣以及顱縫區(qū)細(xì)胞的增殖與分化維持良好的平衡，此外，細(xì)胞的正常凋亡過程也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[4]。上述任何一個過程發(fā)生改變，均可導(dǎo)致顱縫早閉或顱裂，其中以顱縫提早閉合較為多見。

2 顱縫早閉的遺傳學(xué)研究

遺傳學(xué)研究證實多種基因突變、致畸物質(zhì)、機械壓力或血液、代謝紊亂等將導(dǎo)致顱縫早閉[5-6]。截至2008年，與顱縫早閉相關(guān)的突變基因已明確有11個，常見的包括：成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR1，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)GFR3）、轉(zhuǎn)化生長因子 β受體（TGFBR1，TGFBR2）、酪氨酸激酶 Eph/Ephrin 家族蛋白（EFNB1）、胚胎發(fā)育基因 TWIST1、同源盒基因 MSX2、小 GTP酶蛋白家族 RAB（RAB23）、原纖維蛋白基因（FBN1）、細(xì)胞色素P450還原酶基因（POR）等[7-10]。對上述基因及相關(guān)信號通道介導(dǎo)的顱縫細(xì)胞增殖與分化的研究，闡明了顱縫發(fā)育分子調(diào)控機制的重要性與復(fù)雜性。

2.1 顱骨發(fā)育、顱縫閉合的研究模型

目前國際上關(guān)于顱縫早閉分子發(fā)病機理研究的實驗?zāi)Ｐ停饕ǎ孩僬游镲B縫組織或細(xì)胞；②基因修飾動物模型顱縫組織或細(xì)胞；③少數(shù)取材于患者的顱縫組織或細(xì)胞。其中以前兩者為主[11-14]，研究結(jié)果主要反映了非靈長類動物顱縫組織的體內(nèi)發(fā)育情況，以及體外環(huán)境下應(yīng)用各種培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞增殖、人為誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的一系列表型特征，而無法實際反映人體內(nèi)顱縫閉合的過程與分子調(diào)控機制。

針對這一弊端，一些學(xué)者采用了以人為對象的顱縫早閉研究模型，如取材于同一患者受累顱縫區(qū)及正常顱縫區(qū)標(biāo)本，進(jìn)行基因表達(dá)的比較（稱體內(nèi)-體內(nèi)比較），以篩選發(fā)現(xiàn)新的致病基因。由于體內(nèi)受多因素制約且與外界環(huán)境相互影響，所得的結(jié)果往往是最終呈現(xiàn)的表現(xiàn)，而非研究者最為關(guān)心的顱縫閉合中間過程。因此，最常用于人顱縫早閉研究的方法為：取材自同一患者受累顱縫區(qū)及正常顱縫區(qū)體外培養(yǎng)細(xì)胞之間的比較（稱體外-體外比較），該方法不僅可用于基因差別表達(dá)的分析，還可用于顱縫復(fù)合組織不同細(xì)胞群間增殖、分化潛能的功能研究[15-16]。由于倫理道德問題及復(fù)雜實驗技術(shù)的挑戰(zhàn)，從患者或正常人群中獲取顱縫組織、細(xì)胞用于大規(guī)模的實驗研究相當(dāng)困難，上述兩種研究方法主要應(yīng)用于實驗動物如鼠顱縫早閉的研究[13，17-18]。

目前的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，多為人工二維單層培養(yǎng)技術(shù)，與體內(nèi)組織細(xì)胞三維的生長環(huán)境不同。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，組織細(xì)胞在體外環(huán)境下生長，逐漸喪失了原有的性狀，所取得的研究結(jié)果與體內(nèi)的情況不相符，包括導(dǎo)致的基因表達(dá)的顯著差異[19]。因此，目前開展的顱縫細(xì)胞研究，多采用原代或早期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，以減少體外培養(yǎng)對細(xì)胞真實性狀的影響，但由于原代細(xì)胞生存期短，傳代數(shù)局限致所產(chǎn)生的細(xì)胞量不足等原因，致病基因表達(dá)及調(diào)控機制的研究仍具有明顯的限制性。少數(shù)學(xué)者嘗試應(yīng)用轉(zhuǎn)化細(xì)胞系以延長細(xì)胞的生存期，發(fā)現(xiàn)它們可能引起細(xì)胞不典型表征，從而影響實驗結(jié)果。

因此，現(xiàn)有顱縫細(xì)胞研究模型存在的問題主要為：①如何跨越體外培養(yǎng)顱縫細(xì)胞和動物實驗間的鴻溝，更好地模擬活體組織的內(nèi)環(huán)境，最大程度地維持顱骨發(fā)育的體內(nèi)性狀，保持細(xì)胞的功能活性，以全面研究顱縫閉合的過程。②如何將體內(nèi)、體外兩大研究系統(tǒng)更好地結(jié)合，對二者基因表達(dá)的差異進(jìn)行同期比較研究，以更準(zhǔn)確地評價相關(guān)基因在顱縫閉合過程中的作用。③如何克服原代細(xì)胞生存期短，體外培養(yǎng)傳代細(xì)胞性狀逐漸發(fā)生改變而影響實驗結(jié)果等問題，有賴于開發(fā)既能延長顱縫細(xì)胞的生存期，又能最低程度影響細(xì)胞表征的實驗技術(shù)。

近年來的研究趨勢是，制造相關(guān)致病基因修飾小鼠模型，進(jìn)行顱縫早閉遺傳分子機制及基因或細(xì)胞治療的研究。目前較成熟的為成纖維細(xì)胞生長因子及其受體（FGF/FGFR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。FGFR突變可導(dǎo)致Apert、Pfeiffer和Crouzon等顱縫早閉綜合征，基因修飾小鼠模型有：FgfR2+/S252W、FgfR2-Ⅲc+/Δ 基因修飾小鼠模型 （Apert綜合征）[20-22]；FGFR2+/C342Y基因修飾小鼠模型 （Crouzon綜合征）[23]；FGFR1+/P250Arg基因修飾小鼠模型（Pfeiffer綜合征）[24-25]。TGF-β 動物模型包括 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TgfbrⅠ、TgfbrⅡ、TgfbrⅢ，和相關(guān)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因如Smad2、Erk1/2等基因敲除小鼠模型。此外，先天性雙側(cè)冠狀縫早閉兔模型亦常用于顱縫早閉TFG-β信號通路的研究[26-28]。

2.2 顱縫早閉研究的最新進(jìn)展

隨著顱縫早閉發(fā)病機理的深入研究，新的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn)，它們之間的相互作用形成了一個非常復(fù)雜的顱縫閉合分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系。截至目前，已有研究較為明確地闡明了BMPs蛋白介導(dǎo)的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在嚙齒動物顱縫形成過程中的作用機制[29-32]，尚需進(jìn)一步研究全面揭示上述基因的信號通路作用過程。

研究發(fā)現(xiàn)，同一基因突變可致不同的畸形表現(xiàn)型，提示同一基因在不同顱縫間具有特殊的分子信號通路。以額縫的表現(xiàn)最為明顯，人類額縫在出生后不久即閉合，而其他顱縫在1歲以后逐漸融合形成鋸齒狀，相互扣鎖，12歲或以后顱縫才緊閉。與嚙齒動物的情況相近，嚙齒動物的額縫由神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)形成并分隔額骨，屬于神經(jīng)嵴起源，而其它顱縫與神經(jīng)嵴并列或來源于軸旁中胚層[33-35]。許多研究比較了鼠閉合過程中的后額縫與未閉合的冠狀縫、矢狀縫間基因表達(dá)譜的差異，以了解顱縫閉合的基因調(diào)控機制[36-41]。然而，鑒于不同發(fā)育來源的顱縫閉合信號通路各異，上述比較的結(jié)果無法闡明顱縫閉合的分子機制。因此，Coussens等[42]研究同一發(fā)育來源的閉合顱縫與未閉顱縫間的基因表達(dá)差異。研究發(fā)現(xiàn)，與已閉合或正在閉合期顱縫的基因表達(dá)相比，未閉顱縫的 RBP4、GPC3、C1QTNF3、IL11RA、PTN、POSTN 等基因表達(dá)水平較高，提示上述基因在保持顱縫開放或調(diào)控成骨細(xì)胞早期分化中起關(guān)鍵作用；已閉合或正在閉合期的顱縫WIF1、ANXA3、CYFIP2等基因表達(dá)水平較高，提示它們與顱縫早閉發(fā)病的相關(guān)性。此外，他們的研究還發(fā)現(xiàn)，綜合征性與非綜合征性顱縫早閉的基因表達(dá)譜差異甚微，而不同的未閉合顱縫間基因表達(dá)卻有顯著的差異，尤以額縫最為特殊。盡管普遍認(rèn)為顱蓋發(fā)育并未產(chǎn)生軟骨前體，在Coussens的研究中發(fā)現(xiàn)，人字縫和后矢狀縫的形態(tài)發(fā)生過程中可檢測出軟骨特殊基因表達(dá)與組織學(xué)改變，提示顱縫發(fā)育可能存在軟骨生長過程。上述研究深入至不同顱縫水平分析致病基因的差異表達(dá)，為顱縫早閉分子機制的探索開辟了一種新的途徑，通過闡明不同顱縫間各異的發(fā)育機制，為顱縫疾病的非手術(shù)治療奠定了更充實的理論依據(jù)。

為克服體內(nèi)、體外研究系統(tǒng)下檢測的基因表達(dá)結(jié)果與實際顱縫閉合的基因表達(dá)間的差異，Coussens等[19]對顱縫閉合研究模型進(jìn)行了改良，將體內(nèi)、體外兩大研究系統(tǒng)相結(jié)合，對顱縫早閉取材標(biāo)本及同一組織來源的體外培養(yǎng)顱縫細(xì)胞二者間基因表達(dá)的差異進(jìn)行同期比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一基因通過體內(nèi)-體外研究模型檢測的差異程度較體內(nèi)-體內(nèi)模型所表現(xiàn)的差異程度更為突出，這為基因表達(dá)的靈敏檢測提供了便捷，并更能準(zhǔn)確地評價相關(guān)基因在顱縫閉合過程中的作用。此外，通過對完全分化的受累顱縫組織及體外培養(yǎng)非分化成骨細(xì)胞群基因表達(dá)的比較，可篩選出成骨細(xì)胞分化、礦化相關(guān)的基因；與培養(yǎng)細(xì)胞相比，在顱縫組織中表達(dá)下調(diào)的基因則與顱骨發(fā)育、顱縫閉合早期細(xì)胞的分化抑制或誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞的增殖關(guān)系密切。

表1 顱骨發(fā)育、顱縫閉合相關(guān)研究基因Table 1 Genes related to skull growth and cranial suture fusion

表1 續(xù)

表1列出了近年來顱骨發(fā)育、顱縫閉合相關(guān)的主要基因，包括成骨分化相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、骨塑形相關(guān)基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因等[42]。通過對上述基因功能及傳導(dǎo)通路系統(tǒng)、深入地研究，有望進(jìn)一步探索顱縫閉合的分子生物學(xué)機制。

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