藥源性特異質肝損傷及其發生機制的研究進展

蘇怡菁， 江振洲，2， 張 云， 張陸勇，3*

(1.中國藥科大學江蘇省新藥篩選中心，江蘇南京210009;2.中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京210009;3.中國藥科大學 江蘇省藥效學研究與評價服務中心，江蘇南京210009)

20世紀90年代初，藥物開發失敗的主要原因是其難以預測的藥動學特征［1］。隨著藥動學研究的發展，藥物的動力學特征日漸易于被預測，不良反應轉而成為藥物開發失敗的主要原因。如溴芬酸(Hunter E B等，Am JGastroenterol，1999年)和曲格列酮(Kohlroser J等，Am JGastroenterol，2000年)因藥源性肝損傷(drug induced liver injury，DILI)等不良反應而遭撤市，利培酮、曲伐沙星、奈法唑酮等也因此被美國FDA列入警告藥物名單［2-3］。

DILI是一類較為嚴重的藥物不良反應，占藥物不良反應的10% ～15%［4］，占所有急性肝損傷的50%以上［5］，包括可預測的DILI和不可預測的DILI兩大類。對于可預測的DILI，其機制包括破壞細胞內鈣離子穩態、膽汁淤積、活性代謝物毒性、免疫毒性［6］、直接觸發細胞凋亡以及破壞線粒體功能等［7］;不可預測的DILI即為藥源性特異質肝損傷(idiosyncratic drug induced liver injury，IDILI)，是發生頻率最高、最值得引起重視的藥物特異質反應(idiosyncratic drug reaction，IDR)。

IDR僅發生在少數用藥者身上(發生率通常低于5%)，與藥物的藥理效應無關［8］，且與臨床劑量無明顯關系［9］，而與患者年齡、性別、身體狀態及是否飲酒等因素相關［10］，其產生有暫時性和非連續性的特點(Zimmerman H J，Dis Mon，1993年)，較易發生于年老者、女性、炎癥患者和飲酒者［11］，是藥物、用藥者自身狀況和環境綜合作用的結果。IDR發生概率較低，藥物的臨床前研究通常無法預測其發生［12］，其既可能在患者首次或第2次接觸藥物后發生，也可能在經歷數周甚至數月后發生。該類反應涉及人體的各個器官，由于肝臟在藥物代謝過程中處于中心地位，故其成為最易產生IDR的器官［13］。

隨著人們對可預測的DILI的深入研究，因傳統的藥物肝毒性而遭撤市的藥物已日趨減少，IDILI則受到越來越多的關注。然而，由于現有的檢測體系尚難以預測IDILI的發生，一旦一種很有開發前景的新藥被發現可引起IDILI，將導致制藥公司的巨大損失，且此損失不僅表現在經濟上，還表現在諸如企業信譽之類無形資產的損害上，其對受試者帶來的傷害更是難以估量。鑒于此，預測藥物產生IDILI的風險，發現IDILI的可能的標志物，已成為新藥研發中的熱點［14］。雖然目前對IDILI的發生機制尚不明確，研究人員僅從代謝、免疫等角度提出了一些假說;但一些可用于此項研究探索的特異質肝損傷的動物及細胞模型正在逐步建立。

1 藥源性特異質肝損傷的可能機制

從目前的研究來看，IDILI更多的是對一種現象的命名，其機制并不明了。經過長期摸索，人們就IDILI的發生機制提出了若干假說，雖然這些假說之間存在著某些內在聯系，但每一種假說均只涉及IDILI的某一個或幾個方面，至今仍無一種假說能夠對IDILI的機制作出全面的解釋，故應綜合這些假說來探討某個藥物的IDILI。

根據目前的假說，大體可將IDILI的發生機制分為代謝特異質和炎癥特異質。其中，代謝特異質主要與代謝酶的基因多態性有關［15］;炎癥特異質則解釋了排除代謝差異后IDILI發生的主要機制［16］，由于炎癥反應的廣泛存在性，大多數研究都采用輕度炎癥模型來模擬IDILI現象。

1.1 炎癥應激假說

Roth等(Toxicol Appl Pharmacol，1997年)提出，當體內發生急性炎癥刺激時，藥物誘導的肝毒性會發生改變，此時機體更易出現IDILI。中等強度的炎癥刺激可降低機體對藥物產生肝毒性的應答閾值，使藥物治療窗變窄，即藥物在一個本應安全的劑量下產生毒性反應;而藥物的存在反過來亦可擴大炎癥應激的損傷，使原本輕微的炎癥反應造成較嚴重的后果。由此可見，炎癥與IDILI之間的關系可從兩方面來看:一方面，IDILI常伴有炎癥反應的發生;另一方面，輕度的炎癥反應可增加患者對藥物毒性的敏感性。

人及動物中的炎癥反應非常普遍，且許多情況下(如改變膳食習慣、飲酒、胃腸刺激和外科手術等)常伴有輕度的炎癥介質釋放，因此，某些患者可能因在用藥時伴發炎癥而出現特異質反應。有研究發現，少量脂多糖(LPS)可誘發輕度炎癥，而LPS與炎癥細胞表面的Toll樣受體4作用后，數小時內即可引起單核細胞和巨噬細胞浸潤、基因表達的改變和多種炎癥介質或細胞因子的激活，最終通過旁分泌或體循環作用于其他組織細胞，引起全身炎癥反應綜合征。少量LPS進入肝臟后，可通過激活枯否細胞(Kupffer細胞)等而被直接吞噬，而大量LPS則可導致休克、多器官功能衰竭和死亡［17］。

1.2 活性中間代謝產物假說

Kaplowitz等(Ann Intern Med，1986年)提出，藥物在機體中代謝生成的活性產物會與細胞膜上重要的蛋白共價結合，破壞膜完整性，造成細胞內鈣離子紊亂等問題。與正常個體相比，對藥物敏感的個體可能因體內代謝酶的基因多態性，使得藥物的活性中間代謝產物的種類和生成量發生變化。糖尿病治療藥物曲格列酮便是通過活性中間代謝物產生毒性的一個典型例子，其在肝內被細胞色素 P450酶CYP3A4代謝為5種主要的活性產物，后者通過耗竭谷胱甘肽，并與蛋白及其他親核物質結合［18］，造成肝臟損傷。然而，研究發現，許多藥物的活性代謝產物并未顯示出比其原形藥物更高的肝毒性，故而可推測活性中間代謝產物只是某些藥物產生IDILI的原因，但未必是所有IDILI發生的原因［8］。

1.3 基因多態性假說

基因多態性假說與活性中間代謝產物假說存在某些相似之處，即都是個體代謝酶的基因多態性及其導致的對藥物代謝的差異:若某個體的某種藥物代謝酶水平偏低，則會造成此藥在個體體內的代謝速率降低，若此藥物原型比代謝物毒性更大，該個體表現出的毒性反應便更強烈［19］。基因多態性影響毒性的經典藥物是抗結核藥物異煙肼［20］。曾有研究發現，不同種族的人群由于基因的多態性，致使其體內乙酰轉移酶的含量不同，乙酰化速率不同，異煙肼的代謝速率便不同。據此出現快代謝和慢代謝人群之說，其中快代謝人群發生肝毒性的概率大于慢代謝人群［21］。

另外，Gurumurthy等(Am Rev Respir Dis，1984年)還發現，由于體內代謝酶水平的差異，即使不同個體攝入相同劑量的同種藥物，到達毒性閾值的時間也會不同，故毒性出現的時間也不同。基因多態性可決定部分藥物的IDILI效應，但同樣也不是導致IDILI的唯一原因［22］。

1.4 半抗原假說

半抗原假說由Robin等(J Hepatol，1997年)提出，近年來頗受關注。該假說認為，某些化學活性物質或活性代謝產物等小分子化合物本身并不能刺激抗體產生，當與人體細胞內的蛋白共價結合并形成復合物后則有可能被自身免疫系統視為外源性抗原，當機體繼續暴露在藥物環境中時，便會發生快速的免疫反應，導致由B細胞介導的自身抗體的生成和T細胞的激活，最終造成細胞損傷，這種小分子化合物被稱為半抗原。Parker等(Pharmacol Rev，1982年)指出青霉素導致的特異質損傷便與致病性抗體免疫球蛋白E(IgE)相關，青霉素的β內酰胺環可與體內蛋白結合形成抗原，與IgE抗體作用，導致肥大細胞脫顆粒，釋放組胺、白介素(IL)等物質，從而造成組織損傷。

但是，目前的研究結果尚不能明確與藥物及其活性代謝產物結合的體內蛋白種類以及其中可致藥物產生嚴重毒性反應的蛋白。

1.5 危險因子假說

危險因子假說與半抗原假說有一定關聯性。該假說認為，當藥物或其代謝產物與蛋白相結合并同時有一種或多種應激信號產生時，免疫損傷才會形成，而相應的應激信號即為“危險因子”［23］。這些危險因子的種類目前并不清楚，它們有可能是內源性的，并因個體的不同而不同。這些信號可以是輕度的炎癥反應及其間釋放的細胞因子，細胞因子則可激活獲得性免疫系統，而藥物的繼續使用便會造成肝臟損傷［24］。

1.6 線粒體失調假說

研究發現，某些能夠導致IDILI的藥物(如曲格列酮、托卡朋、雙氯芬酸、異煙肼等)可使機體出現三磷酸腺苷水平下調、活性氧增加以及線粒體膜電位下降等線粒體功能失調現象［25］，且其他外源毒性物質、缺氧、炎癥等因素也可改變線粒體功能，從而改變細胞對藥物的敏感性，導致IDILI的產生［26］，因此，線粒體功能失調可能是IDILI產生的一個重要原因。

1.7 適應性缺失假說

對于某一藥物而言，可能其大部分使用者僅產生輕度、可逆的肝毒性，即對藥物產生了適應性，而另一小部分人則不能適應，最終發展為明顯的毒性反應，表現為特異質損傷，這部分人群即被認為存在適應性缺失［27］。例如，Mushin等(Br Med J，1971年)發現，在使用氟烷作為麻醉劑的病人中，20%會產生輕微、可逆的肝損傷，而僅有0.005%的病人發展成肝硬化。

目前對于適應性缺失這一現象背后的原因所知甚少，推測用藥者對藥物的耐受能力可能與環境或基因因素相關。這一假說可與基因多態性假說相互印證，例如某種抗炎細胞因子或抗凋亡蛋白的多態性可使某些個體不能夠適應微小的機體傷害而導致嚴重損傷產生［19］。

2 藥源性特異質肝損傷的研究方法

目前，對IDILI的研究大多采用基于炎癥應激假說而制備的動物輕度炎癥模型，通常的方法是:先通過尾靜脈注射LPS使受試動物處于輕度炎癥狀態，而后再給予受試藥物，以模擬臨床上IDILI發生時的狀況。近年來，由于對高通量篩選可致IDILI的藥物的需求的增加及相關技術的進步，一些體外模型也逐步被建立［28］。

2.1 體內研究方法

動物的體內研究對于探索IDILI的發生機制有著不可替代的作用，理想的動物模型的建立對于實驗研究十分重要［19］。然而，目前用于研究IDILI的大多數動物模型都存在一定缺陷，且沒有一種動物模型能夠獨立預測藥物產生IDILI的可能性，或預測特定病人對某一藥物產生特殊反應的可能性［29］。而且，由于免疫系統的復雜性，擬建立與自身免疫相關的IDILI動物模型更是困難。

Roth等(Toxicol Appl Pharmacol，1997年)發現，對動物同時給予LPS和安全劑量的肝毒性藥物可導致肝臟損傷，其中被研究較早的肝毒性藥物包括雷尼替丁等。雷尼替丁可導致血液中轉氨酶升高，但只在極少情況下導致肝臟衰竭。體內實驗顯示:將雷尼替丁與少量LPS聯用時，LPS能激活中性粒細胞，隨后，雷尼替丁引發免疫反應，誘使機體釋放大量炎癥因子并攻擊正常肝細胞，造成肝臟損傷，這一結果在幾小時內即可顯現。

對乙酰氨基酚(APAP)是經典的藥源性肝損傷藥物，目前雖尚不十分清楚其致肝損機制，但有證據顯示，免疫系統參與了APAP致肝損的過程。例如，Blazka等(Toxicol Pathol，1996年)發現，APAP造成肝臟損傷的嚴重程度與機體內巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細胞因子的水平呈正相關。Laskin等(Toxicology，2001年)提出，巨噬細胞的作用是APAP致肝損機制的一部分。體內研究顯示:在給予APAP前2 h，給大鼠使用巨噬細胞功能抑制劑氯化釓(10 g·L-1)，可有效防止由APAP引起的大鼠肝臟小葉中心壞死，且肝毒性的傳統指標血清轉氨酶也未出現顯著性升高。然而，對于APAP在輕度炎癥模型中的毒性作用，文獻報道結果并不一致:Ganey等［30］指出LPS會顯著增加APAP的肝毒性，而Liu等(Toxicology，2000年)則認為LPS的存在可使APAP的肝毒性降低。

氟烷在極少數情況下可導致較嚴重的特異質肝損。通常給予動物正常劑量的氟烷時并不會引發肝損，但Moult等(Proc R Soc Med，1975年)發現，預先給予苯巴比妥后再給予氟烷，會導致中度肝損傷。推測其可能的機制是，苯巴比妥可導致氟烷在代謝過程中釋放大量的自由基，從而間接造成肝損。

2.2 體外研究方法

由于輕度炎癥對肝細胞的損傷涉及多種細胞的相互作用，目前有關IDILI的體外研究模型尚不多見。Tukov等［31］報道，將大鼠枯否細胞與肝實質細胞聯合培養并用作研究炎癥在藥物肝毒性中作用的體外模型。枯否細胞與肝實質細胞分離于同一只大鼠的肝臟，將2種細胞聯合培養后分為3組，分別加入LPS、APAP或LPS+APAP，觀察各組細胞變化，并測定炎癥因子的分泌情況。結果發現，LPS+APAP組細胞中炎癥因子的分泌增加最為明顯，從而造成了最為嚴重的細胞死亡。提示在體內狀態下，炎癥的存在可能加重藥物的肝毒性作用。此外，Cosgrove等［28］分別應用肝原代細胞和HepG2細胞系，加入LPS及TNF、IFNγ、IL-1α、IL-6等細胞因子，造成炎癥模型，并運用這一模型大規模篩選具有潛在特異質肝損傷作用的藥物。將待篩選的90個藥物分別與LPS及細胞因子同時加入細胞培養基中，測定藥物對細胞增殖的抑制率。結果顯示:19%的藥物與LPS聯用后對細胞增殖的抑制率提高。提示這些藥物存在潛在的特異質肝毒性。

3 總結與展望

目前對于IDILI的研究僅停留在化學藥物的范疇，尚不見對中藥進行IDILI評價的報道。雖然中藥反應中沒有特異質反應的稱謂，但其副作用確實存在因人、因時而異的現象。由于中藥的成分復雜，作用靶點十分廣泛，對于其副作用的把握也就顯得十分困難。

如何界定中藥的特異質肝毒性及探究其成因，都是一個全新的課題。中藥的肝腎毒性是阻礙中藥現代化與國際化的一個重要方面，在制藥行業全面重視特異質肝損傷的今天，嘗試對中藥的特異質反應作一些探索性研究具有重要意義。

目前對藥物特異質肝毒性的研究還處于起步階段，已提出的各種理論尚不能全面解釋臨床遇到的各種情況，運用于臨床前研究的動物模型和細胞模型也有待改進和增加。特異質肝損傷是與人體、藥物、環境都有密切關系的特殊現象，關于它的研究需綜合考慮多種因素的作用。在藥物評價的初期階段，就應考察藥物可能存在的潛在的特異質肝損傷作用，這無論對于藥物研發者還是患者，都有十分重要的意義。

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