氧化鐵顆粒標志干細胞磁共振成像示蹤的研究進展

張懿娜，莫 子(綜述)，張 禹(審校)

(解放軍第105醫院放射科，合肥 230031)

通過干細胞移植來修復或替代受損組織的臨床治療方法一直是醫學研究的熱門，其中核心問題之一是如何觀察移植后干細胞的作用部位及生長分化情況。近年來，各種迅速發展的成像技術既可以檢測患者體內干細胞的位置，也提高了動物實驗的可信度，尤其是磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術可以無創無輻射地長期示蹤被氧化鐵顆粒標志的干細胞。

1 活體細胞成像技術的比較

干細胞按分化能力大致分為三類:①取自受精卵和早期胚胎(受精1～3 d)的全能干細胞;②從胚泡(4～15 d)內細胞群中提取的胚胎干細胞;③多能干細胞可以形成一些其他組織但并非全部三個胚層的定型細胞［1］。目前，多種疾病(如腦缺血、脊髓損傷、心肌梗死等)，均在進行干細胞移植治療的臨床試驗研究，但安全性和有效性尚無定論。移植細胞的時空分布狀態對于評估移植的路徑、劑量、周期、效率、細胞類型來說很重要，這些信息不僅有利于監測和改進治療方案，而且可以驗證此療法的安全和有效性。因此，用于體內細胞追蹤的細胞成像技術非常重要。

用于活體研究的細胞成像技術主要有磁共振成像(magnetie resonance imaging，MRI)、CT、正電子發射計算機斷層掃描(positron emission tomography，PET)、單光子發射計算機斷層掃描(single photon emission tomography，SPET)、光學成像技術和超聲波成像技術。臨床最需要的是一個可提供高空間分辨率、深部組織探測、長時間跟蹤、動態觀察、環保安全的成像技術［2］。超聲價格低廉，應用廣泛，但其空間分辨率和探測深度難以勝任細胞顯影方面的應用，雖然近些年靶向超聲造影劑的實驗性應用有助于提高分辨率，但是這種通過血液循環積聚在特定靶組織上的造影劑的循環半衰期較短，可能對小血管內皮細胞有害，而且超聲檢測敏感性較低［3］。光學技術通過被熒光轉基因物質標志的供體細胞的生物發光進行細胞定位成像，可以提供優良的分辨率，但穿透力弱，且這種轉基因物質目前未被批準使用［4］。因此，光學的方法仍然只能作為小動物的一種顯像模式。

由于同位素標志物(例如In)的半衰期很短，SPECT的檢測周期有限。PET是一種有前景的成像技術，因為其不受深度的限制能夠反映細胞代謝，但是空間分辨率較差，而且面臨著與SPECT同樣的示蹤同位素半衰期較短的問題［2］。然而，最近的基因轉染技術克服了后者的限制，Cao等［5］利用PET對轉染了18F標志的單純皰疹病毒胸苷激酶基因的供體細胞進行了數周的跟蹤。另外，微型硅元素PET探測器的開發、γ相機針孔嵌入技術的應用以及信號處理方法的進步都進一步提高了PET的空間分辨率和γ光子采集效能。新近的CT雖然應用了雙源技術和迭代重建法的能譜成像，但是對于體內的細胞檢測并不敏感。而且，像CT、PET、SPECT這些檢查方法難以避免電離輻射，在檢查中必須盡量減少活體的照射劑量。

一直以來，很多學者對MRI示蹤細胞技術的興趣濃厚，相比而言，磁共振的空間分辨率優于PET，但檢測的敏感性低于PET，而且1H MRI圖像有時在示蹤細胞和復雜的本底信號的區分上(如含鐵血黃素、出血灶、金屬鈣、小靜脈等)缺乏特異性。研究者已經開始嘗試用含19F的特殊物質標志細胞后進行19F MRI成像［6］，這種方法可排除組織本底信號，僅對濃聚的細胞群進行特異性 MRI，Himmelreich等［7］在氧化鐵標志細胞MRI前使用順磁性造影劑或吸入氧和5%二氧化碳的混合氣體使血管舒張，以此減少本底小靜脈的干擾。新近的化學飽和位移傳遞依賴的造影劑的使用不僅可以通過選擇性飽和脈沖進行切換式增強成像來降低本底信號，而且可以與超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)共同進行MRI增強成像，這為MRI同時檢測兩種不同細胞群落提供了可能性［8］。無論如何，MRI在空間分辨率和檢測敏感性之間擁有良好的平衡，而且無電離輻射，這些優點使MRI成為一種最實用的細胞顯像技術。

2 用外源性氧化鐵顆粒標志干細胞

靜脈注射氧化鐵離子顆粒的磁共振細胞成像主要用于網狀內皮系統細胞的示蹤，應用有限。MRI的另一種細胞示蹤法是在體外用氧化鐵顆粒標志細胞，細胞標志可在細胞膜上黏附氧化鐵顆粒或把他們載入細胞內，目前已經有很多的細胞類型被氧化鐵顆粒標志，并且被MRI記錄，如T細胞、單核細胞、膠質瘤細胞、神經干細胞、巨噬細胞、原始內皮細胞等［9-10］。

干細胞MRI監測的敏感性主要受限于被攝取的氧化鐵微粒數量，每個細胞載有的氧化鐵微粒越多，則信噪比和分辨率越高。因此，要不斷改進標志技術來增加干細胞對氧化鐵顆粒的攝取量，然而氧化鐵微粒的干細胞攝取受到細胞表面特定受體、顆粒理化性質、細胞種類、培養基性質等多種因素的影響。

2.1 顆粒表面成分和電荷特性對干細胞攝取的影響 氧化鐵顆粒常包被右旋糖酐或者其他成分，這種包被材料常攜帶靜電荷，在水中，顆粒在水分子的碰撞及相互靜電排斥力下做布朗運動，從而保持懸浮狀態而不發生凝聚。實驗者設計了不同的顆粒外衣來增強或者避免顆粒-細胞相互作用，例如聚乙二醇化的氧化鐵顆粒可避免細胞膜上調理素作用，最終被巨噬細胞所吞噬［9］，這是因為聚乙二醇外衣具有親水性、電中性，而沒有氫供體或受體，從而與調理素之間缺乏親和力。顆粒外衣的電荷極性也會影響攝取，Harush-Frenkel等［11］比較了與 SPIO 相似大小的分別帶陽性和陰性電荷的多乳酸化合物顆粒，發現帶陽性電荷者更易被HeLa細胞攝取，這是因為陰離子顆粒只通過胞吞作用，而陽離子顆粒除了由網格蛋白和細胞質膜微囊介導的胞吞外，還通過巨胞飲作用攝取。

由電荷性質所自然附屬的顆粒電位可能也對細胞攝取效率起著重要的作用，研究者發現包被有檸檬酸鹽外衣的超小超順磁性氧化鐵顆粒(very small superparamagnetic iron oxide particles，VSOP)相對于相似大小的其他無電荷顆粒來說，可更好地被巨噬細胞攝取，而包被有酸質外衣的AMNP(acid-coated anionic magnetic nanoparticle)(電位為 -30 mV)，相對于相似大小不攜帶電荷的包被右旋糖酐外衣的ferumxotran，更易被巨噬細胞及HeLa細胞吞噬［12］。

2.2 氧化鐵顆粒配體耦聯對干細胞攝取的影響利用生物配體耦聯氧化鐵顆粒來促進受體介導的細胞吞噬作用是一種改進的方法。Liwen等［13］發現在標志濃度(指培養液單位體積內的鐵含量)約0.1 mg Fe/mL時，與右旋糖酐氧化鐵結合物顆粒相比，人類免疫缺陷病毒轉錄反式因子與胺化的右旋糖酐交叉聯合的氧化鐵結合物顆粒能更好地被脾臟內皮細胞攝取。當然，TAT(trans-activator transcription)介導的氧化鐵顆粒進入細胞的機制尚有爭論。有觀點認為這不依賴于細胞表面受體而是通過脂筏介導的巨噬細胞吞噬作用，也有的認為TAT本身進入細胞可能不依賴受體，但是與其他大分子耦聯進入細胞則需要受體介導的細胞吞噬作用［14］。除了肽類，抗體也能介導受體的細胞吞噬作用，多種細胞膜上都含有大量的轉鐵蛋白受體，轉鐵蛋白抗體標志SPIO能促進人類造血干細胞對鐵離子的攝取，攝取濃度高達每細胞9.8 pg，遠超過對普通SPIO的攝取濃度每細胞 2.4 pg［15］。CD11c(樹突狀細胞特異性抗體)則能促進樹突細胞對SPIO的攝取［16］。

以抗體參與的定向受體介導的細胞吞噬作用有個固有的問題，就是對靶受體的種族特異性的附著，這就要求每個抗體耦聯的SPIO有特異對應的目標種屬和細胞類型;抗體在人和其他動物體內具有交叉性，這可能涉嫌與異種基因移植方面的條例相悖;抗體的成本昂貴。因此，該方法可能更多地用于人體外實驗。

2.3 顆粒大小對干細胞攝取的影響 顆粒被細胞吞噬的速度和數量與其組成和直徑都有關系。對于巨噬細胞而言，當顆粒直徑＜2 μm時，被攝取的顆粒數量與顆粒的直徑呈正比例關系;當直徑由2 μm增加到4.6 μm時，被攝取的顆粒數目逐漸減少，這是因為此時顆粒的大小已接近細胞大小的緣故。有的細胞僅吞噬某一種特定顆粒，如白細胞更多地吞噬直徑500 nm至1 μm的苯乙烯化合物顆粒，對其他大小的顆粒幾乎不攝取。關于SPIO也有相似結果，吞噬細胞和單核細胞更多的吞噬直徑約60 nm的包被有羧基化右旋糖酐的SPIO，而不是有類似外衣但直徑更小的SPIO顆粒。

關于顆粒大小對非吞噬細胞吞噬作用的影響的研究較少。Matuszewski等［17］比較后發現，當包被有羧基化右旋糖酐外衣的SPIO顆粒直徑介于17～65 nm之間時，肺癌細胞較多地吞噬較大的顆粒。Rejman等［18］證明當聚苯乙烯顆粒的直徑在 50～500 nm范圍內增加時，鼠黑素瘤細胞對它的吞噬作用逐漸減弱，當顆粒達到1 μm時，則不再被吞噬。Thorek等［19］發現，當用直徑33 nm以上的氧化鐵顆粒逐步標志人類T細胞時，其攝取能力在顆粒直徑為107 nm時達到頂峰，而在107 nm至1.4 μm范圍內時攝取作用逐漸減弱。其實在Thorek等［19］的研究中要準確推斷出T細胞攝取不同顆粒直徑的模式是很難的，因為他采用了不同外衣的多種顆粒，如右旋糖酐(33～107 nm)、苯乙烯(207～289 nm)、二氧化硅(1.4 μm)包被的顆粒。如前所述，氧化鐵顆粒的外衣性質也對攝取有影響。Lee等［20］發現骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)對氧化鐵微凝膠體(microgel iron oxide particles，MGIO)的攝取能力和大小有依從性，在直徑78～766 nm時，600 nm的MGIO可以達到每細胞33 pg的最大攝取濃度，這是ferucarbotran制劑的3～6倍。有趣的是，內皮干細胞無論是用600 nm的MGIO標志還是用ferucarbotran標志，對鐵的攝取濃度是一樣的(每細胞 26～28 pg)［10］。

因此，有些細胞攝取能力與顆粒大小有依賴性，比如單核細胞、肺癌細胞及黑素瘤細胞，而巨噬細胞和BMSC在某個特定的顆粒直徑時會有最大的攝取能力。另外，一些細胞現在仍不能確定是對顆粒大小無選擇性還是對顆粒外衣性質不敏感，比如內皮祖細胞。相對于巨噬細胞，非吞噬細胞可能是在很小的直徑范圍內最大量地吞噬顆粒。

（3）鉆孔爆破要求高。①由于該水電站工程為長緩坡鉆孔模式，而高拱壩拱肩槽開挖基面坡度最低在1/2.3之間，整體坡度變化趨勢不夠明顯，對預裂鉆孔角度控制提出了較大的難題；②在工程施工期間，要求預應力錨固區質點振動速率在1.5～2.0cm/s之間，而巖體振動速度應在9.0cm/s以下，對振動爆破要求較高。

2.4 標志的持續時間和濃度對干細胞攝取的影響

目前認為無論顆粒類型、大小及細胞類型，標志的持續時間和標志濃度與顆粒的細胞攝取濃度均呈正相關，但兩者達到一定程度后細胞攝取出現飽和狀態。Thorek等［19］發現，對＜100 nm包被右旋糖酐外衣、200～300 nm 苯乙烯外衣及1.4 μm 二氧化硅外衣的氧化鐵顆粒的T細胞攝取濃度，隨標志時間的延長而有所增加，但在4 h后達到飽和。另外，還證實＜100 nm包被右旋糖酐外衣的顆粒的攝取在標志濃度25 mg/L時達到飽和，后兩種顆粒則在標志濃度100 mg/L時達到飽和。Wilhelm等［12］用30 nm的AMNP分別標志HeLa細胞和巨噬細胞，在標志濃度同樣是500 mg/L情況下，兩種細胞達到飽和的持續時間分別為5 h和10 h，這也進一步說明了不同細胞種類的標志效率的差異性。大多數學者認為，盡管隨著標志濃度的增加攝取濃度可以升高，但培養液內過多的聚合物和自由基能抑制干細胞分化、引起細胞凋亡、降低細胞能動性，因此一般遵循最長24 h的標志持續時間和最大200 mg/L的標志濃度。

2.5 電穿孔和轉染試劑在干細胞攝取中的應用受DNA轉染技術的啟發，電穿孔和轉染試劑(transfection agents，TA)被用于促進細胞對氧化鐵顆粒的攝取。電穿孔法轉染基因的方法是將外源DNA與宿主細胞混合于電穿孔杯中，在高頻電流作用下細胞膜出現許多小空洞，外源DNA通過小空洞進入胞內，現在此法已成功用于細胞的SPIO標志。Walczak等［21］在用ferumoxide標志鼠 MSC時運用電穿孔技術，使鐵的攝取濃度達到每細胞11.5 pg，而普通標志的攝取濃度為每細胞3 pg。電穿孔法標志效率雖然很高也不影響細胞活性，但制約因素太多，如電壓、電流、持續時間、溶液導電性、酸堿度等，因此實際應用難度大，一旦電參數調整不當將影響細胞活性和標志效率。

用于SPIO標志的轉染試劑主要有陽離子物質和脂質體兩種，最常用的是陽離子物質多聚左旋賴氨酸(poly-l-Lysine，PLL)和硫酸魚精蛋白。將PLL與ferumoxide按一定比例調制成絡合物后，再與人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)一起培養，hMSC攝取濃度可以達到每細胞116 pg，硫酸魚精蛋白與ferumoxide形成的絡合物可使hMHC攝取濃度達到每細胞11 pg［22］。雖然這些陽離子轉染因子能促進細胞的攝取，但不是毫無缺陷。Arbab等［23］用Ferumoxide-魚精蛋白標志hMSC時發現hMSC的全部分化能力不受影響，但Kostura等［24］發現用 Ferumoxide-PLL標志法會影響干細胞的軟骨分化能力。看來這種有害效應是PLL的結果，而非ferumoxide的影響，目前關于轉染試劑對干細胞活性影響的詳細試驗仍較缺乏。另有學者的研究［25］表明，表面上看lipofactamine脂質體轉染試劑介導的SPIO攝取量增加了，但只是與細胞膜的結合，并不是真正的細胞內攝取，而硫酸魚精蛋白雖然能使ferumoxide在小鼠的神經干細胞中進行完整的細胞內攝作用，但在其他類型的細胞中該作用則不完全。這是否說明轉染試劑標志法的細胞攝取SPIO能力與轉染試劑的類型、標志條件和細胞類型有關呢?

另外，轉染試劑標志法的另一個特征是雖然細胞吞噬作用可隨著鐵粒子的標志濃度增加而增強但不呈線性關系，同時還可以提高細胞攝取的飽和閾值從而進一步提升標志濃度。這個現象可能和TA-SPIO絡合物的組分相對含量引起自身特性的動態變化有關，這方面的了解和TA-DNA絡合物比起來還不夠深入，TA-DNA的絡合物由于兩者組分的相對含量不同，可以形成球狀、桿狀和環狀結構，而且在幾個小時內可以動態地變化。已有學者［26］證實，TA-SPIO的絡合物直徑依賴于它的組分的相對含量，在一定比值時會產生沉淀。因此，使用轉染試劑標志法時針對不同細胞類型和標志濃度都需要一種不同的最佳條件，而做到這一點是很難的。

2.6 培養液的性質對干細胞攝取的影響 在標志細胞時，顆粒的理化性質會受到培養液微環境的影響。研究發現［21］，和無血清的培養液比較，含10%血清的培養液可以增加ferumoxide的攝取。單晶質氧化鐵顆粒(monocrystalline iron oxide particles，MION)受血漿的調理后，巨噬細胞和癌細胞攝取濃度分別增加6倍和2倍，這是由于受調理素作用的MION是通過補體C3介導的巨噬細胞清除作用被攝取的，其效率高于通過細胞吞噬的入胞作用。但是，Wilhelm等［12］卻發現HeLa細胞對受調理素作用后的AMNP的攝取會由原來的每細胞16 pg降低至每細胞1 pg。實際上，在對PLL-SPIO絡合物的攝取過程中，漿核比較大的細胞對培養液中血清的存在不敏感，而在無血清培養液中，漿核比較小的造血系細胞的攝取則會增加［2］。總之，含或不含血清的培養液對不同類型的細胞攝取濃度的影響是不同的。

3 用轉基因方法進行內源性氧化鐵標志干細胞的研究進展

活體中有專門貯存氧化鐵的機制，包括鐵蛋白、轉鐵蛋白和轉鐵蛋白受體，這些蛋白質在特定細胞中的表達會隨著細胞內鐵的貯存量的增而增多，使這些細胞能被MRI檢測到。促進細胞產生內生性的氧化鐵顆粒或可取代外源性顆粒標志細胞。

3.2 鐵蛋白 鐵蛋白是人體細胞內鐵的重要儲存形式。Grabile等［28］利用11.7 T高分辨率基于體素的MRI發現剔除鐵調節蛋白2的小鼠腦內由于鐵蛋白鐵過載引起的低T2值像素量增多，由此推測MRI或可檢測鐵代謝異常。然而，Cohen等［29］發現通過在轉基因小鼠的心和肝臟中誘導過多的鐵蛋白表達，MRI雖檢測到這些組織的弛豫率產生了25%的變化，但細胞內鐵含量僅增加每細胞0.2 pg，所以誘導基因表達的MRI細胞顯像敏感性并不會很高。Deans等［30］用鐵蛋白和轉鐵蛋白受體基因共同轉染的方法也只使細胞內鐵含量增加每細胞14 fg，對敏感性的改善無太大貢獻。最近Bennett等［31］試圖通過調控鐵蛋白的聚集反應來升高相同鐵含量干細胞的弛豫率，以此提升MRI細胞顯像的敏感性。

3.3 趨磁細菌的magA基因 趨磁細菌是一種在體內形成納米磁性顆粒(磁小體)，并能在外磁場作用下作定向運動的細菌，這些磁小體由包有類脂膜的復雜的氧化鐵結晶組成，它無生物毒性、顆粒小、形態大小均一、顆粒間不聚集，目前已證實magA基因是菌體內參與磁小體產生的基因之一。Zurkiya等［32］將一種常用的人包裝細胞株293FT細胞轉染magA基因后，293 FT細胞可以產生直徑3～5 nm磁小體顆粒，使細胞內鐵的含量增加每細胞0.55 pg。MagA的應用研究雖然還處在初期，但目前的結果說明它將是很好的磁共振報告基因，其發展前景十分廣闊。

4 結語

MRI作為一種能夠探測被氧化鐵標志的細胞的成像方法，具有活體監測、長時間跟蹤、高空間分辨率等優勢，近年來外源性氧化鐵顆粒標志干細胞方法已經得到很大的改進，新近的用轉基因方法進行內源性氧化鐵顆粒標志干細胞的方法也方興未艾，這些方法在更好穩定干細胞活性的基礎上為進一步提高MRI對干細胞的檢測敏感性和特異性提供了更廣闊的發展空間。而影響干細胞對氧化鐵顆粒攝取數量和能力的因素很多，因此在尋找一種能夠轉變為臨床應用的標志方法的過程中，干細胞MRI顯像仍面臨諸多挑戰，包括:①標志濃度的下降，研究表明細胞內的標志物在兩個子代細胞中的含量近似平分，如果移植的細胞快速分裂，那么標志物的濃度下降過快并可能會影響監測;②標志物的轉移，已經有學者［33］發現，干細胞內的氧化鐵顆粒可以轉移到宿主的巨噬細胞而導致對植入的干細胞增殖、分化等情況誤判;③干細胞的定量，氧化鐵標志的干細胞MRI的細胞定量方法仍在起步階段，已有學者［34］嘗試分析氧化鐵顆粒標志干細胞的R2*弛豫率與細胞數量之間的關系;④盡管探索了一些新方法，但從本體的低信號中探測少量細胞仍是困難的。另外，部分容積效應、信噪比、空間分辨率、掃描時間、后處理算法等如何平衡才能將MRI的干細胞檢測敏感度達到最佳水平也要在工作中不斷總結。

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