造血干細胞體外擴增方法研究進展

余 艷，羅 振(綜述)，程臘梅(審校)

(中南大學生殖與干細胞研究所，長沙 410078)

造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)具有高度自我更新、多向分化潛能，能長期重建各系造血和免疫功能。HSCs移植是治療白血病、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病和某些實體瘤(淋巴瘤、乳腺癌等)的有效手段。自1989年首次利用臍血干細胞移植治療范科尼貧血報道以來，臍血干細胞移植受到了廣泛的關注。但由于臍血中HSCs的數量有限，臍血干細胞移植治療主要應用于兒童和低體質量患者。為滿足大齡兒童和成年患者臍血HSCs移植的需求，需通過體外擴增獲得足夠數量的HSCs。近年來隨著分子生物學、遺傳學等學科的不斷發展，人們對HSCs生物學和造血調節有了更深入的了解，HSCs體外擴增效率得到了極大的提高。

1 添加細胞因子擴增HSCs

將骨髓、外周血或臍血來源的HSCs，置于含有多種細胞因子的培養體系中懸浮培養是早期體外擴增HSCs的主要方法。不同實驗室所用細胞因子組合也不盡相同，但是通常都含有干細胞因子(stem cell factor，SCF)、白細胞介素(interleukin，IL)-3、IL-6 和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)，Flt-3/Flk2配體(Flt-3/Flk-2 Ligand， FL)。SCF和FL主要作用造血干/祖細胞，促進造血干/祖細胞分裂和增殖，抑制凋亡［1］;IL-3主要刺激造血祖細胞的增殖和分化［2］;TPO 能夠廣泛作用于造血細胞的各個階段，主要調節巨核細胞系的分化［3］。應用上述細胞因子組合擴增HSCs，雖然造血細胞的總數和造血祖細胞數量得到了顯著的擴增，但原始HSCs在體外擴增過程中發生分化，擴增后的造血細胞降低了自我更新和重建造血的能力［4］。因此，在擴增HSCs的同時，如何維持干細胞特性是HSCs體外擴增中亟待解決的問題。

近年來，人們對造血微環境的調控作用有了更深入的了解，發現造血微環境中的某些蛋白質對維持HSCs的不分化和自我更新具有重要作用，因此嘗試將這些蛋白質用于HSCs的體外擴增。原始HSCs表達Notch信號分子受體，活化Notch信號能抑制HSCs分化，促進HSCs增殖，但是Notch的配體Delta-1在可溶狀態下雖能與Notch結合，卻不能活化該信號通路［5］。Delaney等［6-7］將 Delta-1 的胞外結構域的編碼序列與IgG1的Fc域的編碼序列融合，純化得到Delta-1 ext-IgG;在體外擴增培養時先將Delta-1ext-IgG固定于培養器皿中，固定化的Delta-1 ext-IgG能夠激活 HSCs的 Notch信號通路;利用固定化的Delta-1ext-IgG輔以細胞因子 SCF、FL、IL-6、IL-3、TPO擴增HSCs，培養17～21 d，CD34+細胞擴增達222倍，同時造血重建能力增強16倍。

Wnt蛋白是一類分泌型糖蛋白，參與HSCs的自我更新和分化的調節。β連鎖蛋白是Wnt信號通路中重要的信號分子，Wnt蛋白與受體結合后抑制β連鎖蛋白的磷酸化，導致胞內β連鎖蛋白聚集，繼而進入細胞核與T細胞因子/淋巴增強因子家族作用，促進特定基因的表達。活化的β連鎖蛋白或Wnt1的過量表達能夠抑制HSCs分化，促進HSCs的增殖［8］。此外，地諾前列酮也可通過上調β連鎖蛋白的表達作用于Wnt信號通路，參與HSCs增殖和分化的調節［9］。

多效蛋白(pleiotrophin，PTN)是在許多組織和細胞系中廣泛表達的分泌型肝素結合蛋白，該蛋白不僅調節細胞增殖和遷移，還參與血管的發生。近年研究發現PTN對小鼠HSCs的維持至關重要，同時還能促進人臍血HSCs的體外擴增。Himburg等［10］運用PTN聯合細胞因子SCF、FL和TPO擴增人臍血CD34+CD38-細胞，HSCs可擴增近40倍;將擴增后的細胞移植到NOD/SCID小鼠體內，4周后檢測到小鼠外周血中人源的細胞數是對照組的3倍，8周后增加至7倍。

2 添加化學分子擴增HSCs

臨床研究發現銅離子(Cu2+)在HSCs的發育過程中具有重要的調節作用，Cu2+能使細胞內產生氧化應激，從而影響細胞的增殖、分化和凋亡。體外培養臍血干細胞時，Cu2+能夠增加活性氧的濃度，促進HSCs分化;在含有細胞因子(SCF、TPO、FL和 IL-6)的培養體系中加入Cu2+螯合劑四乙烯戊胺(tetraethylenepentamine，TEPA)，CD34+細胞可擴增159倍，為對照組的 3.5 倍［11］。HSCs擴增劑(StemRegenin 1，SR1)是一種嘌呤衍生物，在含SCF、FL和IL-6細胞因子的無血清培養體系中，加入SR1，人臍血CD34+細胞可擴增50倍，SRCs擴增達17倍［12］。

p38是屬于細胞分裂素活化蛋白激酶家族信號轉導激酶，參與調節多種細胞的分化、衰老和凋亡過程。當內環境穩定時，p38在HSCs的自我更新和正常的造血過程中不發揮作用，但是在氧化應激條件下活化的p38則誘導HSCs衰老［13-14］。SB203580是一種小分子化合物，能夠特異性抑制p38的活性。在正常的含氧條件下(21%)p38的活化抑制HSCs的擴增，加入SB203580后，HSCs的擴增效率增加2 倍［15］。

3 基質細胞共培養擴增HSCs

HSCs自我更新、多向分化均依賴于HSCs所處的微環境。微環境中的基質細胞、基質細胞分泌的細胞因子和細胞外基質及造血細胞本身均參與造血穩態的調控。骨髓造血微環境中的基質細胞包括成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞、網狀細胞、脂肪細胞和間充質細胞，這些基質細胞在體外對HSCs均有不同程度的擴增作用［16］。Kawano等［17］將人端粒末端轉移酶催化亞基轉染人骨髓基質細胞建立基質細胞系，支持臍血CD34+細胞體外增殖。骨髓間充質干細胞也具有擴增HSC/HPC的作用，臍血單個核細胞與充質細胞共培養14 d，CD133+細胞和CD34+細胞可分別擴增30倍和8倍，集落形成單位擴增約200倍［18］。小鼠骨髓基質細胞來源的OP9細胞系轉染Delta-1基因后，在擴增造血HSCs的同時，能有效地促進CD34+CD38-Lin-的自我更新［19］。此外，內皮細胞(endothelial cells，ECs)也能有效促進HSCs的體外擴增。在共培養體系中，ECs表達的Notch配體，激活HSCs的 Notch信號，抑制 HSCs的分化，促進HSCs增殖的同時能保持HSCs的自我更新潛能［20］。轉染了E4ORF1基因的ECs(E4ORF1+ECs)能夠在無血清和細胞因子的條件下長期培養［21］。為了排除ECs生長所需的生長因子對HSCs擴增的影響，Butler等［20］利用 E4ORF1+ECs與 HSCs在無血清和細胞因子的情況下進行共培養，擴增后的HSCs能夠長期植入所有的受體小鼠體內。基質細胞共培養較單純用細胞因子的培養體系，擴增HSCs的效率更高，但共培養體系成分復雜，影響因素較多，不便于大規模的擴增培養和標準化，并且異體的基質細胞有排斥和傳播疾病的風險，不適合臨床上的應用。

4 HSC基因修飾

SALL4是一種新發現的含鋅指結構的轉錄因子，對胚胎干細胞多能性的維持至關重要［22］。SALL4在人白血病細胞系和早期急性髓性白血病細胞中表達，可能與正常HSCs的自我更新有關［23-24］。SALL4基因過表達的CD34+細胞在體外擴增培養2個月后，HSC擴增可達10 000～15 000倍，并且植入能力和長期重建造血能力均得到顯著增強［25］。

除了HSCs體外擴增效率外，HSCs的植入率也是影響HSCs移植成功與否的關鍵。CD34+細胞過表達CXCR4基因，能夠增強基質細胞衍生因子1介導的趨化作用，增加HSCs移植后的植入率，提高HSCs移植的成功率［26］。

5 其他方法

骨髓血液中的氧張力較其他組織低，相當于頸靜脈血的氧張力［27］。細胞周期緩慢的HSCs趨向于定植在遠離血管的低氧區，細胞周期活躍的HSCs位于血管附近的區域［28］。低氧條件培養CD34+細胞能夠提高其植入后造血重建能力［29］。低氧環境中的HSCs保持低的擴增速率避免氧化應激的損傷，并且能夠表達更高水平的Notch-1、端粒酶和細胞周期抑制因子 p21［30］。

納米纖維是一種能滲透的纖維，具有可控制的拓撲特性，這種結構能夠顯著提高表面積與體積比。以納米纖維作為支架材料，模擬體內造血微環境結構擴增HSCs，能明顯提高HSCs的擴增效率。將網狀的納米纖維材料黏附于24孔培養板底部，將臍血來源的CD133+細胞加入到納米材料制成的支架上進行擴增培養，擴增培養10 d后細胞總數增加了225倍，并且仍高表達 CD133(24%)和 CD34(93%)［31］。近年來用旋轉的生物反應器來擴增培養HSC，細胞數可擴增435倍，CD34+細胞擴增 30 余倍［32］。生物反應器的利用避免了共培養異體基質細胞疾病傳播的風險，降低了成本，具有極大的應用價值。

6 展望

進一步優化HSCs擴增培養體系，提高HSCs的擴增效率，為臨床移植治療提供充足的HSCs，需要更加深入地研究HSCs增殖、分化機制，尋找最佳的細胞因子組合，并利用生物工程技術，建立更加優化的大規模培養裝置。另外，可通過尋找新的HSCs來源，以滿足日益增長的HSCs需求，例如利用胚胎干細胞或誘導多潛能干細胞在體外向造血定向誘導分化。此外，擴增的HSCs用于臨床前還需要進行大量的隨機臨床試驗，以驗證其安全性和有效性。隨著干細胞領域研究的不斷發展，移植技術的不斷完善，擴增的臍血HSCs將更加廣泛地應用于臨床治療中。

［1］ Mohamed AA，Ibrahim AM，El-Masry MW，et al.Ex vivo expansion of stem cells:defining optimum conditions using various cytokines［J］.Lab Hematol，2006，12(2):86-93.

［2］ Astori G，Malangone W，Adami V.et al.A novel protocol that allows short-term stem cell expansion of both committed and pluripotent hematopoietic progenitor cells suitable for clinical use［J］.Blood Cells Mol Dis，2001，27(4):715-724.

［3］ Woo SY，Kie JH，Ryu KH，et al.Megakaryothrombopoiesis during ex vivo expansion of human cord blood CD34+cells using thrombopoietin［J］.Scand J Immunol，2002，55(1):88-95.

［4］ Shih CC，Hu MC，Hu J，et al.Long-term ex vivo maintenance and expansion of transplantable human hematopoietic stem cells［J］.Blood，1999，94(5):1623-1636.

［5］ Varnum-Finney B，Wu L，Yu M，et al.Immobilization of Notch ligand，Delta-1，is required for induction of notch signaling［J］.J Cell Sci，2000，113 Pt 23:4313-4318.

［6］ Delaney C，Varnum-Finney B，Aoyama K，et al.Dose-dependent effects of the Notch ligand Delta1 on ex vivo differentiation and in vivo marrow repopulating ability of cord blood cells［J］.Blood，2005，106(8):2693-2699.

［7］ Delaney C，Heimfeld S，Brashem-Stein C，et al.Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution［J］.Nature Medicine，2010，16(2):232-236.

［8］ Staal FJ，Clevers HC.WNT signalling and haematopoiesis:a WNTWNT situation［J］.Nat Rev Immunol，2005，5(1):21-30.

［9］ Goessling W，North TE，Loewer S，et al.Genetic interaction of PGE2 and Wnt signaling regulates developmental specification of stem cells and regeneration［J］.Cell，2009，136(6):1136-1147.

［10］ Himburg HA，Muramoto GG，Daher P，et al.Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells［J］.Nature Medicine，2010，16(4):475-482.

［11］ Peled T，Landau E，Mandel J，et al.Linear polyamine copper chelator tetraethylenepentamine augments long-term ex vivo expansion of cord blood-derived CD34+cells and increases their engraftment potential in NOD/SCID mice［J］.Exp Hematol，2004，32(6):547-555.

［12］ Boitano AE，Wang J，Romeo R，et al.Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells［J］.Science，2010，329(5997):1345-1348.

［13］ Navas TA，Mohindru M，Estes M，et al.Inhibition of overactivated p38 MAPK can restore hematopoiesis in myelodysplastic syndrome progenitors［J］.Blood，2006，108(13):4170-4177.

［14］ Zhou L，Opalinska J，Verma A.p38 MAP kinase regulates stem cell apoptosis in human hematopoietic failure［J］.Cell Cycle，2007，6(5):534-537.

［15］ Wang Y，Kellner J，Liu L，et al.Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase promotes ex vivo hematopoietic stem cell expansion［J］.Stem Cells Dev，2011，20(7):1143-1152.

［16］ Nagasawa T，Omatsu Y，Sugiyama T.Control of hematopoietic stem cells by the bone marrow stromal niche:the role of reticular cells［J］.Trends Immunol，2011，32(7):315-320.

［17］ Kawano Y，Kobune M，Yamaguchi M，et al.Ex vivo expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitor cells using a coculture system with human telomerase catalytic subunit(hTERT)-transfected human stromal cells［J］.Blood，2003，101(2):532-540.

［18］ Robinson SN，Ng J，Niu T，et al.Superior ex vivo cord blood expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Bone Marrow Transplant，2006，37(4):359-366.

［19］ Fernández-Sánchez V，Pelayo R，Flores-Guzmán P，et al.In vitro effects of stromal cells expressing different levels of Jagged-1 and Delta-1 on the growth of primitive and intermediate CD34+cell subsets from human cord blood［J］.Blood Cells Mol Dis，2011，47(4):205-213.

［20］ Butler JM，Nolan DJ，Vertes EL，et al.Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells［J］.Cell Stem Cell，2010，6(3):251-264.

［21］ Seandel M，Butler JM，Kobayashi H，et al.Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(49):19288-19293.

［22］ Yang J，Gao C，Chai L，et al.A novel SALL4/OCT4 transcriptional feedback network for pluripotency of embryonic stem cells［J］.PLoS One，2010，5(5):e10766.

［23］ Ma Y，Cui W，Yang J，et al.SALL4，a novel oncogene，is constitutively expressed in human acute myeloid leukemia(AML)and induces AML in transgenic mice［J］.Blood，2006，108(8):2726-2735.

［24］ Yang J，Chai L，Gao C，et al.SALL4 is a key regulator of survival and apoptosis in human leukemic cells［J］.Blood，2008，112(3):805-813.

［25］ Aguila JR，Liao W，Yang J，et al.SALL4 is a robust stimulator for the expansion of hematopoietic stem cells［J］.Blood，2011，118(3):576-585.

［26］ Kahn J，Byk T，Jansson-Sjostrand L，et al.Overexpression of CXCR4 on human CD34+progenitors increases their proliferation，migration，and NOD/SCID repopulation［J］.Blood，2004，103(8):2942-2949.

［27］ Grant WC，Root WS.The relation of O2in bone marrow blood to post-hemorrhagic erythropoiesis［J］.Am J Physiol，1947，150(4):618-627.

［28］ Kubota Y，Takubo K，Suda T.Bone marrow long label-retaining cells reside in the sinusoidal hypoxic niche［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，366(2):335-339.

［29］ Eliasson P，J?nsson JI.The hematopoietic stem cell niche:low in oxygen but a nice place to be［J］.J Cell Physiol，2010，222(1):17-22.

［30］ Lekli I，Gurusamy N，Ray D，et al.Redox regulation of stem cell mobilization［J］.Can J Physiol Pharmacol，2009，87(12):989-995.

［31］ Das H，Abdulhameed N，Joseph M，et al.Ex vivo nanofiber expansion and genetic modification of human cord blood-derived progenitor/stem cells enhances vasculogenesis［J］.Cell Transplantation，2009，18(3):305-318.

［32］ Liu Y，Liu T，Fan X，et al.Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood in rotating wall vessel［J］.J Biotechnol，2006，124(3):592-601.