低氧誘導因子1α在骨損傷修復中的研究進展

陳小丹，何家才

(安徽醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，合肥230032)

腫瘤的手術切除、交通傷、感染或其他原因導致的骨缺損，給患者帶來結構和功能上的影響。骨組織含血量很大，占心排血量的5%～20%。血液可為骨提供氧氣、營養(yǎng)、礦物質、可溶性因子、不同類型的細胞和移走代謝產物，從而維持生長發(fā)育。損傷后，血流中斷或減少而導致局部缺氧。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)及其目標基因能夠調控骨系細胞、誘發(fā)長入新血管，從而發(fā)揮其在骨缺損修復中的促進作用［4-5］。

1 HIF-1α的生物學特點

1992 年Semenza等［1］在研究低氧下誘導促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)基因轉錄的低氧誘導增強子的特點中，發(fā)現了HIF。低氧條件下，它能激活數百個目標基因的轉錄。

HIF 由 HIF-α(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)和 HIF-β組成，這兩個亞單位都是堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構。HIF-1是目前研究最為透徹的HIF家族中的一種亞型，由HIF-1α和HIF-1β組成。HIF-1α在常氧下很快降解，但低氧時穩(wěn)定，是相對分子質量為120×103的蛋白質為功能性調節(jié)亞基，由826個氨基酸組成。HIF-1的穩(wěn)定性及其反式激活作用的調節(jié)都是通過轉錄后修飾來控制，如羥基化、乙酰化、磷酸化、亞硝基化修飾。HIF-1α包含:①PAS(PER-ARNT-SIM)、HLH 域是 HIF-α 和HIF-β結合成有活性的HIF-1的結合位點，同時也是介導HIF-1與目標基因上的低氧反應元件結合的部位。②氧依賴降解域參與常氧下細胞內HIF的降解和低氧下的穩(wěn)定性和活性［2］。常氧下，位于此區(qū)域的402和564的脯氨酸在脯氨酸羥化酶［3］以及氧、鐵、2-酮戊二酸的輔助因子的共激活下羥基化，位于532的賴氨酸乙酰化后，均能為腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau，VHL)識別并可與HIF-1結合，之后與E3泛素連接酶結合而形成脯氨酸-VHL-E3復合體，最后被蛋白酶體降解。低氧下，一些中間代謝產物或鐵抑制脯氨酰羥化酶的活性，從而使HIF-1α表達穩(wěn)定，并移入細胞核內與HIF-1β結合成HIF-1異源二聚體。③C末端轉錄激活域(C-terminal activation domain，C-TAD)和N末端轉錄激活域(N-terminal activation domain，N-TAD)是轉錄激活區(qū)調節(jié)HIF的轉錄活性。HIF-1α的N-TAD和C-TAD受不同機制調節(jié)。C-TAD為 HIF-1α基因轉錄激活所必需，而N-TAD在功能上似乎不是必要的。常氧下，位于C-TAD上的803位天冬氨酸被天冬氨酸羥化酶FIH-1羥基化，限制了HIF與p300/CBP的結合，從而阻礙HIF-1α的降解，兩區(qū)域之間是結構抑制域，對轉錄激活區(qū)域有負調控作用。④核定位信號序列是低氧條件下調節(jié)HIF-1α轉移入核的特殊堿基序列。

2 HIF-1α對血管生成的調控

HIF-1α是啟動血管形成的核心調控因子，通過調控靶基因參與血管形成，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與血管生成素2、整合素共同作用，形成血管芽，隨后形成血管腔;調控一氧化氮合酶2、內皮素1等控制血管的緊張度;誘導基質金屬蛋白酶、纖溶酶原活化因子受體和抑制子等參與基質代謝和血管的成熟;EPO促進紅細胞生成、增加微血管的密度。然而，HIF-1α對VEGF和EPO的調控最為重要。VEGF與VEGF受體1、VEGF受體2結合后能促進內皮細胞分裂、增殖，向低氧和乏血管區(qū)遷移，降解細胞外基質來參與血管的形成。陳博等［4］用HIF-α基因轉染大鼠的骨骼肌細胞后可增加具有正常功能的VEGF蛋白的分泌，促進血管內皮細胞的增殖。Li等［5］研究發(fā)現，與VEGF表達增強的野生型HIF-1α組比較，不表達VEGF HIF-1α剔除組鼠胚胎成纖維細胞的遷移明顯降低。Geiger等［6］在兔橈骨缺損處植入VEGF165-活化基因基質后用免疫組織化學染色法顯示VEGF組的血管生成量是對照組的2～3倍。EPO通過促進內皮細胞增殖、遷移，上調VEGF、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)，增加血小板對微血管的黏附能力及其活性以促進血管的發(fā)生。Kawachi等［7］在豬的心肌梗死試驗中發(fā)現，與對照組比較，EPO組有大量血管形成，且HGF、FGF、IGF、VEGF 表達升高，同時誘導前體內皮祖細胞向缺血區(qū)遷移促進血管的發(fā)生。Kato等［8］通過建立小鼠后肢局部缺血模型發(fā)現，與磷酸鹽緩沖液治療相比，EPO治療組恢復了血流，黏附血小板的微血管密度和可溶性血小板上P選擇蛋白增加，中和P選擇蛋白后血流受損，黏附血小板的微血管密度降低。

3 HIF-1α對成骨細胞的調控

HIF-1α有利于恢復低氧環(huán)境中成骨細胞增殖活性，加快其增殖速率，增強成骨功能。第一，直接調控:HIF-1α促進成骨細胞骨鈣素(osteocalcin，OC)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表達，OC由成骨細胞合成分泌，是評價骨形成、骨轉換和成骨細胞活性的特異性指標，在骨礦化中起重要的作用。ALP是成骨細胞早期分化的標志。第二，通過其他基因間接調控:①VEGF的調控直接影響前體成骨細胞，促進成骨細胞的分化和增強再生骨的礦化。②IGF1和IGF2，目前發(fā)現IGF1更有潛能，它能夠促進成骨細胞的增殖和分化并最終增加骨基質的生成以及OC和ALP的合成，同時它對前體成骨細胞和成熟破骨細胞還有抗凋亡保護作用。IGF2能夠調節(jié)間充質干細胞向成骨細胞分化。③轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族包括TGF-β、骨 形 成 蛋 白 (bone morphogenetic protein，BMP)兩個亞家族，主要是由成骨細胞和血小板產生。TGF-β信號能促進前體成骨細胞的增殖、早期分化和基質的產生。BMP 中的 BMP-2、-4、-5、-6、-7都具有很強的成骨能力，BMP-2能大大增加OC的表達，誘導成骨細胞的分化，是強有力的成骨性分化因子。BMP-7能誘導ALP的表達和促進基質礦化。④骨特異性轉錄因子RUNX2，RUNX2的兩個主要亞基是T1和T2，對成骨細胞的分化和成熟具有重要的意義。T1 RUNX2在早期的前體成骨細胞中表達，能促進BMP2的形成，BMP2刺激T2 RUNX2的產生，繼之促進成骨細胞的分化和成熟。RUNX2與HIF-1α共同存在前體成骨細胞的胞核內，兩者在結構和功能上協(xié)同促進成骨作用。第三，誘導血管形成間接調控:增加的血管侵入骨組織，能夠提供成骨性因子和運送前體成骨細胞，進而啟動成血管和成骨作用的級聯(lián)反應。

此外，HIF-1α可刺激外周血的單核細胞向成骨細胞分化［9］。Shomento等［10］研究發(fā)現，HIF-1α 缺失鼠的松質骨體積明顯減少，骨形成的速度延緩，同時成骨細胞的增殖減慢。劉曉東等［11］研究證實，與21%O2相比，2%O2時成骨細胞的HIF-1α和VEGF表達增加，OC水平增高，同時成骨細胞增殖、堿性磷酸酶分泌以及鈣結節(jié)形成能力也逐漸增強。另外，激活成骨細胞的HIF-1α信號通路能有效地對抗雌激素降低引起的骨缺失［12］。

4 HIF-1α對破骨細胞的調控

破骨細胞是負責骨吸收的多核細胞，來源于循環(huán)系統(tǒng)中單核巨噬細胞系的造血前體干細胞，為氧感應細胞。HIF-1α主要是通過靶基因VEGF、Bcl-2/腺病毒E1B 19×10結合蛋白3(Bcl-2 and adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3)、血管生成素4等間接調節(jié)破骨細胞活性和分化，增加其骨吸收能力。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)是破骨細胞分化和成熟的必要條件［13］。低氧時VEGF表達，它能替代M-CSF促進破骨細胞的分化，募集單核細胞和破骨細胞，并支持破骨細胞的存活和活性［14］。其機制為VEGF激活單核細胞的VEGF受體1，從而刺激單核前體破骨細胞的遷移;VEGF與激活的VEGF受體1結合使前體單核細胞表達細胞核因子κB受體活化因子，并與成骨細胞上的RANKL結合來促進單核破骨細胞分化;破骨細胞自身分泌的VEGF與VEGF受體2結合后反過來支持自身的存活和活性;HIF-1α通過下游基因BNIP3來調節(jié)破骨細胞的自噬作用。Dandajena等［15］把外周血單核細胞和成骨細胞共培養(yǎng)發(fā)現，只有低氧時成骨細胞的HIF、VEGF和RANKL表達上調時才能觀察到破骨細胞。說明單核細胞向破骨細胞分化與RANKL、HIF、VEGF緊密聯(lián)系。HIF-1α對破骨細胞功能的調控部分是通過血管生成素4調節(jié)破骨細胞活性來實現的，后者通過激活不同的細胞內信號通路來增強破骨細胞的活性［16］。Zhao等［17］研究發(fā)現，低氧通過HIF-1α/BNIP3調控前體破骨細胞的自噬作用使其胞質內容物降解和結構調整以形成破骨細胞，此外HIF-1α對軟骨細胞的存活、增殖、分化和軟骨基質的形成也有非常重要的影響［18］。HIF-1α可以促進間充質干細胞向成骨性細胞系分化，并且增加ALP的活性和Ⅰ/Ⅲ型膠原的產生［19］。

5 結語

HIF-1α與血管發(fā)生、成骨細胞、破骨細胞的調控緊密相關。新生血管可以向骨損傷處輸送成骨細胞和前體破骨細胞，血管內皮細胞還能誘導間充質干細胞分化為成骨細胞系。此外，血管生成因子(如VEGF)通過刺激內皮細胞產生成骨性生長因子調節(jié)骨祖細胞的募集，成骨細胞的增殖、分化及破骨細胞的活性。

骨缺損修復依然是臨床上面臨的一個嚴峻的挑戰(zhàn)，不論是自體骨還是異體骨移植都有來源受限、損害供體部位和免疫排斥反應等問題，HIF-1α在骨缺損修復中具有重要的促進作用。然而，它受多因素調控，如何在時間、量上控制它，使其最有利于骨生成，又不會出現不良反應，還需要進一步研究。同時HIF-1α對一些骨系細胞功能的調控還有許多問題沒有得到證實，快速形成新的脈管網絡也依然是個挑戰(zhàn)。HIF-1α在血管再生方面有很突出的優(yōu)勢，但它在常氧下易分解，因此目前很多實驗研究通過基因工程來穩(wěn)定HIF-1在常氧下表達，并與骨組織工程技術聯(lián)合應用，從而為骨缺損的治療提供一個新的途徑。

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