陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率影響因素的研究進(jìn)展

黃柯鑫 綜 述 趙 斌 審 校

廣東醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)，廣東省湛江市 524000

20世紀(jì)80年代，F(xiàn)elgner等首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了陽(yáng)離子脂質(zhì)體可用于DNA轉(zhuǎn)染。近年來(lái)，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用都已取得了很大的進(jìn)展。陽(yáng)離子脂質(zhì)體安全性好、操作簡(jiǎn)單，被廣泛用于DNA、RNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。陽(yáng)離子脂質(zhì)體在基因轉(zhuǎn)染的成功運(yùn)用，為基因轉(zhuǎn)移開(kāi)辟了一條新途徑，并顯示出廣闊的前景。然而，陽(yáng)離子脂質(zhì)體參與體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染的過(guò)程中，受到諸多因素的影響，現(xiàn)就其進(jìn)展綜述如下。

1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制

陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染主要通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其機(jī)制可簡(jiǎn)述為：帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電的基因（DNA或RNA）形成脂質(zhì)－基因復(fù)合物（lipoplexes，簡(jiǎn)稱脂質(zhì)復(fù)合物），陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面過(guò)剩的正電荷通過(guò)靜電作用吸附于帶負(fù)電的細(xì)胞膜上［1］，而脂質(zhì)體本身具有的親脂性，使脂質(zhì)復(fù)合物通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞或細(xì)胞膜融合作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)涵體；脂質(zhì)復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中或進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞核內(nèi)釋放基因，從而在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯。

2 影響陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的因素

2.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體的構(gòu)型 深入探究陽(yáng)離子脂質(zhì)體的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)提高其轉(zhuǎn)染效率有著重要的意義［2］。陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由一個(gè)陽(yáng)離子兩性化合物即細(xì)胞轉(zhuǎn)染素（cytofectin）和一個(gè)中性（或兼性）輔助磷脂組成。常用的輔助磷脂有二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1，2二油酸甘油3磷脂酰膽堿（DOPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、膽固醇（Chol）、磷脂酰膽堿（PC）等。細(xì)胞轉(zhuǎn)染素與輔助磷脂結(jié)合能形成穩(wěn)定的雙層膜結(jié)構(gòu)，降低陽(yáng)離子頭部的毒性作用，同時(shí)為陽(yáng)性脂質(zhì)提供細(xì)胞滲透功能，因此，中性輔助脂成分可增強(qiáng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染活力［3］。其中，中性磷脂DOPE的細(xì)胞膜去穩(wěn)定化作用，能直接誘導(dǎo)脂質(zhì)體膜與內(nèi)涵體膜融合，從而使DNA迅速釋放。研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子脂質(zhì)單體有錐形、非反轉(zhuǎn)六角形（HⅠphase）和反轉(zhuǎn)六角形（HⅡphase）等不同空間構(gòu)型，當(dāng)膜融合作用占優(yōu)勢(shì)時(shí) HⅡphase的結(jié)構(gòu)形式最利于轉(zhuǎn)染［4］。

2.2 陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備 除了陽(yáng)離子脂質(zhì)體本身的構(gòu)型特點(diǎn)外，脂質(zhì)體的制備差異，對(duì)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性也起到重要的影響，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率。在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體從溶酶體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的速率，對(duì)轉(zhuǎn)染效果有著直接的影響。在陽(yáng)離子脂質(zhì)和中性輔助磷脂這兩種成分的基礎(chǔ)上，添加其他的輔助材料，也可提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Shigeta等［5］合成了新型的組氨酸－半乳糖化膽固醇衍生物Gal2His2C42Chol（2），具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，能加速陽(yáng)離子脂質(zhì)體從溶酶體釋放、進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程，從而使細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯提高。此外，有研究者運(yùn)用某些輔助成分如多肽、多聚物等，利用其滲透作用或去垢劑類似作用機(jī)制使溶酶體破裂，轉(zhuǎn)染效率也可明顯提高 。

2.3 DNA的大小及構(gòu)型 研究表明質(zhì)粒DNA的大小 對(duì) 轉(zhuǎn) 染 效 率 有 很 大 影 響［6］。Katrien 等［7］以DOTAP/DOPE陽(yáng)性脂質(zhì)體為基因載體，將3種構(gòu)型（超螺旋、開(kāi)環(huán)和線型）的質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超螺旋質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率最高。Lukacs等［8］通過(guò)對(duì)Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小于100bp的DNA片段可以在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中自由移動(dòng)。而隨著DNA片段的增大，其在細(xì)胞質(zhì)中的遷移能力也隨之降低。這是由于核孔對(duì)于進(jìn)入細(xì)胞核的DNA具有“尺寸限制功能”。此外，小分子DNA更容易與帶負(fù)電荷的物質(zhì)相互競(jìng)爭(zhēng)交換而從LPP中解離出來(lái)。

2.4 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的正負(fù)電荷比例 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體中兩者的正負(fù)電荷比例是影響基因轉(zhuǎn)染效率的重要因素。其中的一個(gè)重要原因是，兩者所帶電荷比例可直接影響復(fù)合體的粒徑；而當(dāng)lipoplexes的直徑尺寸在0.4～1.4μm 范圍內(nèi)時(shí)，具有更高的 轉(zhuǎn) 染 效 率［9，10］。Almofti等［11］通 過(guò) 電 鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的電荷比值為1時(shí)粒徑最大，認(rèn)為電荷比值為1時(shí)，脂質(zhì)體與DNA靜電斥力消失，易于集聚，大于或小于1時(shí)，產(chǎn)生靜電排斥作用使脂質(zhì)體DNA均勻分散。實(shí)驗(yàn)證明，脂質(zhì)體與DNA的電荷比在1∶1時(shí)，形成的復(fù)合體的粒徑最大，在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，基因轉(zhuǎn)染效率最高［12，13］。另外，帶有稍微過(guò)剩陽(yáng)離子的lipoplexes，其轉(zhuǎn)染效率更高［14］。

2.5 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的大小 陽(yáng)離子脂質(zhì)體帶正電荷，核酸大分子帶負(fù)電。當(dāng)兩者混合時(shí)，可在瞬間發(fā)生相互作用而形成脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體——lipoplexes［15］。lipoplexes的大小和形狀受陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA的摩爾比影響，且呈動(dòng)態(tài)變化。當(dāng)正負(fù)電荷比例接近1時(shí)，則有明顯的大小及結(jié)構(gòu)的改變［16］。Rejman等［17］2004在研究復(fù)合體的粒徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞作用的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，粒徑在200nm～1μm之間的粒子，其通過(guò)細(xì)胞膜內(nèi)陷作用進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程比較緩慢，使得DNA在到達(dá)溶酶體之前就從核內(nèi)體中釋放出來(lái)，避免其在溶酶體內(nèi)降解。而粒徑小于200nm的復(fù)合體在進(jìn)入細(xì)胞后，迅速被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)并發(fā)生降解。

2.6 生物學(xué)因素 當(dāng)轉(zhuǎn)染應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞時(shí)，受諸多生物學(xué)因素的干擾，例如DNA核酸酶對(duì)核酸的降解，體內(nèi)吞噬細(xì)胞活化后對(duì)DNA的清除作用以及血漿中帶電荷成分對(duì)陽(yáng)離子的影響等。

2.6.1 細(xì)胞外干擾因素。在血清環(huán)境中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率較低，其中一個(gè)重要原因是血清蛋白中和了脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物表面的正電荷，使其與帶負(fù)電的細(xì)胞表面的靜電作用受到影響。另外，血液中小分子脂類和大分子苷類可破壞復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，從而降低其轉(zhuǎn)染效率。Xu等［18］通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察推測(cè)，血清和血漿成分可能使脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物過(guò)早地發(fā)生聚集、結(jié)構(gòu)改變與分解。針對(duì)此現(xiàn)象，有研究者用聚乙二醇等作為修飾成分，屏蔽陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面過(guò)多的正電荷，從而抑制復(fù)合體的聚集 ，同時(shí)可阻止lipoplexes與帶負(fù)電的血清蛋白相互作用［19］使復(fù)合體逃避巨噬細(xì)胞的清除。

2.6.2 細(xì)胞內(nèi)干擾因素。目前普遍認(rèn)為抑制DNA從核內(nèi)體中釋放的因素以及DNA進(jìn)入細(xì)胞核的干擾因素，均對(duì)陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重要影響。細(xì)胞在有絲分裂時(shí)，外源性DNA更容易被細(xì)胞核攝取［20］。由此認(rèn)為，DNA進(jìn)入細(xì)胞核的一個(gè)主要機(jī)制是依賴于細(xì)胞分裂時(shí)的有絲分裂被動(dòng)進(jìn)入胞核。但對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)染提示DNA也可以通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸穿過(guò)核膜。然而，在非有絲分裂的細(xì)胞中，粒徑比核孔大的DNA穿過(guò)核孔的機(jī)制還尚未清楚［20］。此外，脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率還跟轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及融合程度等因素有關(guān)。

3 前景展望

在一系列非病毒載體中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因傳遞系統(tǒng)是最有前景的傳遞系統(tǒng)之一。目前研究者發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同的靶細(xì)胞尋找高特異性的靶向性配體具有廣闊的前景［21］。例如，利用不同性能的分子材料，如親水性陽(yáng)離子聚合物、表面活性劑、糖蛋白和多糖等對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾，可在生物體內(nèi)的某個(gè)過(guò)程起到調(diào)控作用，從而提高轉(zhuǎn)染效率。

脂質(zhì)－復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞膜的調(diào)節(jié)機(jī)制是基因轉(zhuǎn)染過(guò)程一個(gè)重要的限速步驟，如果能從信號(hào)分子以及具體作用機(jī)制的角度，詳細(xì)闡明影響轉(zhuǎn)染效率的因素，將有利于進(jìn)一步提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。

隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)的不斷發(fā)展，陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基因機(jī)制的研究將不斷深入，轉(zhuǎn)染過(guò)程中的影響因素也不斷得到闡明，從而為提高轉(zhuǎn)染效率提供重要的理論指導(dǎo)。

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