頭孢泊肟酯片微生物限度檢查方法的建立

范震洪，黃佳

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院藥劑科，北京 100050

頭孢泊肟酯片為口服第三代頭孢菌素類藥物，具有廣譜、殺菌力強(qiáng)等特點[1]。為保證臨床應(yīng)用的安全性，目前各國藥典不僅對注射用藥品規(guī)定必須進(jìn)行無菌檢查，而且對口服制劑的微生物污染狀況也有明確的質(zhì)控指標(biāo)[2-6]。在對具有抗菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查時，應(yīng)首先消除其抗菌活性，并通過實驗驗證抗菌活性去除的是否徹底，以保證檢驗結(jié)果的有效性[7]。薄膜過濾法是去除藥品中抗菌成分的最有效方法。但由于頭孢泊肟酯片具有較強(qiáng)的抗菌活性，使得無法簡單采用水溶液作為沖洗劑去除抗菌成分。大量的沖洗，不僅影響濾膜的孔徑，使截留在膜上的細(xì)菌濾過，而且還使污染的細(xì)菌受到損傷，從而降低陽性檢出率，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，利用β-內(nèi)酰胺酶能使β-內(nèi)酰胺類抗生素失去抗菌活性的特點[8-13]，在培養(yǎng)基中加入β-內(nèi)酰胺酶作為中和劑，可有效地去除頭孢泊肟酯片的抑菌作用，據(jù)此，建立了頭孢泊肟酯片微生物限度檢查法；并對實驗中的標(biāo)準(zhǔn)操作(SOP)方法進(jìn)行了探討。

1 儀器與材料

WJ-6無菌檢查儀(天津市羅根科技有限公司)，800型離心機(jī)(上海手術(shù)器械十廠)，YJA型勻漿儀(臺州市椒江五星機(jī)械儀器有限公司)，一次性薄膜過濾器(規(guī)格：NS01-75D2，批號：201100209；孔徑：0.45μm；材質(zhì)：尼龍膜)，生化培養(yǎng)箱(德國Binder公司)。頭孢泊肟酯片(50mg/片)：海南海靈制藥廠。

培養(yǎng)基為膽鹽乳糖增菌液、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂(批號分別為01104192、0110828、0110314、0110808、0110902、0110520，北京三藥科技開發(fā)有限公司，靈敏度實驗符合《中華人民共和國藥典》2010規(guī)定[2]附錄107-113)。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC-B63501]、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC-B 26003]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC-B 44102]、白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC-F 98001](中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心)，黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC-F 98003](中國藥品生物制品檢定所)。

β-內(nèi)酰胺酶：300萬單位/mL(中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法

參照2010年版《中華人民共和國藥典》二部微生物限度檢查法[2]附錄107-113實驗，簡述如下。

2.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu[2]附錄107-113的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液[2]附錄94。

2.2 供試液制備 稱樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100mL至無菌的勻漿罐中，勻漿2 min(3000r/min)，制成質(zhì)量濃度為100g/L的供試液，將此供試液離心5min(500r/min)，取上清液備用。

2.3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)檢查驗證試驗

2.3.1 平皿法 取質(zhì)量濃度為100g/L的供試液1mL入1個平皿，加入驗證菌，然后每皿加約20mL營養(yǎng)瓊脂作細(xì)菌計數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂作霉菌和酵母菌計數(shù)，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。

2.3.2 薄膜過濾法 取供試品的上清液1mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，在最后一次的沖洗液中，加入驗證菌，濾過后，將薄膜貼至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

2.4 控制菌檢查驗證實驗 取供試品的上清液10mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，將薄膜加至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的100mL膽鹽乳糖增菌液后，再加入菌數(shù)為50～100cfu的大腸埃希菌懸液，30～35℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 微生物限度檢查法的建立 由于頭孢泊肟酯片具有較強(qiáng)的抗菌活性，但對霉菌和酵母菌基本無抗菌活性[1]，為快速建立有效的微生物限度檢查方法，我們采用薄膜過濾法結(jié)合在培養(yǎng)基中加入中和劑的方法，進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)檢查和控制菌檢查，采用平皿法進(jìn)行霉菌和酵母菌計數(shù)檢查；結(jié)合2010年版中國藥典中規(guī)定的常用驗證菌株[2]，選擇枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]和金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]為細(xì)菌的代表菌株，白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F) 98001]為霉菌和酵母菌的代表，分別進(jìn)行薄膜過濾法和平皿法實驗條件的篩選；進(jìn)行實驗條件篩選的菌株稱為篩選菌株[8-13]。

采用平皿法檢查頭孢泊肟酯片時，樣品經(jīng)1:200稀釋后對篩選菌株白色念珠菌的回收率平均為94%，在此條件下，用黑曲霉進(jìn)一步驗證，其回收率也平均為97%。說明常規(guī)的平皿法(1:200)，即可滿足頭孢泊肟酯片霉菌和酵母菌計數(shù)檢查的需要。

采用薄膜過濾法結(jié)合在培養(yǎng)基中加入中和劑的方法，去除頭孢泊肟酯片的抗細(xì)菌活性，當(dāng)沖洗量為300mL時，枯草芽孢桿菌的回收率平均為85%，而金黃色葡萄球菌的回收率平均為91%(表1)，提示頭孢泊肟酯片對枯草芽孢桿菌較金黃色葡萄球菌更敏感，故僅采用枯草芽孢桿菌作為篩選菌株即可滿足實驗條件篩選的需要(表1)，證明了方法的有效性。

結(jié)合細(xì)菌計數(shù)檢查的驗證試驗結(jié)果，進(jìn)行控制菌檢查的驗證實驗。當(dāng)采用薄膜過濾法結(jié)合在培養(yǎng)基中加入中和劑的方法，且總沖洗量為300mL(100mL/次)時，已能滿足控制菌檢查的基本要求。

驗證試驗中篩選菌株的意義在于明確指征藥品的抑菌成分是否被消除，如篩選菌株生長良好，則說明供試品在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，可以照此檢驗條件進(jìn)行進(jìn)一步的驗證；如其它陽性菌在此條件下生長微弱、緩慢或不生長者，則說明該檢驗條件未能完全去除該藥物的抑菌作用，應(yīng)對檢驗條件進(jìn)一步調(diào)整以達(dá)到完全去除供試品抑菌成分的目的。因此篩選菌株選擇的正確與否是能否實現(xiàn)快速建立抗菌藥物微生物限度檢查方法的關(guān)鍵。

3.2 實驗操作對結(jié)果的影響

3.2.1中和劑對實驗結(jié)果的影響 由于頭孢泊肟酯片具有較強(qiáng)的抗菌活性，單純采用薄膜過濾法，不能去除頭孢泊肟酯片的抗菌活性，β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)作為中和劑，在β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳上結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時發(fā)生了不可逆的反應(yīng)，結(jié)果使其成為開環(huán)物，從而重建了β-內(nèi)酰胺酶，或是與頭孢泊肟酯片的羰基碳的酰胺鍵相互作用，使頭孢泊肟酯片失活[14,15]。故確定β-內(nèi)酰胺酶作為中和劑。對中和劑的加入量進(jìn)行選擇，發(fā)現(xiàn)中和劑的加入量過小，不能完全消除藥物的抗菌活性；中和劑加入量過大，會造成不必要的浪費，容易污染[9]。以2mLβ-內(nèi)酰胺酶作為中和劑，可滿足實驗的需要。

3.2.2 培養(yǎng)基和沖洗液的溫度對實驗結(jié)果的影響 由于β-內(nèi)酰胺酶在55℃時活性較高[16]，所以制備含β-內(nèi)酰胺酶平板時，培養(yǎng)基的溫度應(yīng)控制55±5℃之間。進(jìn)行薄膜過濾時，如沖洗液的溫度較低，藥物及其輔料不能充分溶解，易堵塞薄膜；適當(dāng)提高沖洗液的溫度至45℃時，可以增加供試液的濾過性，降低頭孢泊肟酯片在薄膜上的吸附；但沖洗液的溫度大于45℃，容易傷害藥品中污染的雜菌，影響檢驗結(jié)果。

3.3頭孢泊肟酯片微生物限度檢查法操作的SOP 稱樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100mL至無菌的勻漿罐中，勻漿2min(3000r/min)，制成質(zhì)量濃度為100g/L的供試液，將此供試液離心5 min(500r/min)，取上清液備用。

取1:10的供試液，采用平皿法1mL/皿，測定霉菌和酵母菌數(shù)。

取供試品的上清液1mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，將薄膜貼至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，測定細(xì)菌數(shù)。

取供試品的上清液10mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，將薄膜加至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的100mL膽鹽乳糖增菌液中，測定控制菌。

3.4 對頭孢泊肟酯片微生物限度檢查法驗證工作的思考 由于β-內(nèi)酰胺類抗生素具有相似的抗菌活性，因此，對本文未涉及的β-內(nèi)酰胺類抗生素，如頭孢唑啉、替卡西林等[17,18]，可以根據(jù)相應(yīng)藥物的原始實驗驗證數(shù)據(jù)，直接選用其敏感菌株，例如枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌進(jìn)行實驗條件的篩選。選擇實驗條件時，最重要的是確定中和劑的最佳加入量，使其既可以完全消除藥物的抗菌活性，又不會由于過量出現(xiàn)污染和浪費。

通常，當(dāng)藥品生產(chǎn)條件發(fā)生改變(如更換產(chǎn)地、更換輔料、改變生產(chǎn)工藝等)或檢測條件發(fā)生改變(改換檢測實驗室等)時，對微生物限度檢查方法應(yīng)進(jìn)行再驗證。由于進(jìn)行再驗證時，藥品中的活性成分未發(fā)生改變，故其抗菌譜也未改變，因此我們認(rèn)為再驗證工作僅需針對藥典規(guī)定的全部驗證菌株中的最敏感菌株即可，而不必對全部菌株再進(jìn)行驗證。即對頭孢泊肟酯片進(jìn)行再驗證時，僅需證明實驗中最敏感菌株(枯草芽孢桿菌)的回收率大于70%，即可說明檢查方法有效，而無需再逐一驗證大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率。采用這種方法，即可保證檢驗方法的有效性，又節(jié)省了大量人力、物力，使得驗證工作成為日常檢驗的一部分成為可能。建議藥典逐漸收載各抗菌藥物的最敏感驗證菌株作為質(zhì)控菌株，方便日常工作。

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