微囊藻毒素分子印跡聚合物的制備及性能研究

申 晴， 崔莉鳳， 趙 碩

(1．北京工商大學 食品學院，北京 100048;2．河北聯合大學 輕工學院，河北 唐山 063000)

微囊藻毒素分子印跡聚合物的制備及性能研究

申 晴1， 崔莉鳳1， 趙 碩2

(1．北京工商大學 食品學院，北京 100048;2．河北聯合大學 輕工學院，河北 唐山 063000)

以微囊藻毒素MC-LR為模板，采用本體聚合法制備微囊藻毒素分子印跡聚合物，優化制備過程．通過電子顯微鏡、孔隙度分析、紅外吸收等對其進行表征，并研究其反應機理和吸附性能．結果表明，單體∶模板∶交聯劑配比為0.9×106∶1∶1.2×106，洗脫時間25 min時為優選條件，最大吸附量為153.7 μg/g，此分子印跡聚合物對MC-LR具有顯著的特異性吸附作用．

微囊藻毒素MC-LR;分子印跡聚合物;本體聚合;吸附性能

為了確保飲用水的安全健康，我國《地表水環境質量標準》(GB3838—2002)中對生活飲用地表水源地提出微囊藻毒素MC-LR的標準為0.001 mg/L．微囊藻是藍藻水華中的優勢藻，它能產生一類環狀七肽結構的微囊藻毒素(microcystins，MC)［1］．微囊藻毒素的種類較多，目前發現有大約80種異構體［2］，其中MC-LR是已知毒性最強、急性危害最大的一種淡水藻類毒素，是最強的肝臟腫瘤促進劑［3］．要確切地檢測微囊藻毒素及其異構體，提高富集和分離技術是這方面的研究熱點．分子印跡技術是最近在分離領域中發展起來的一門新興技術［4］，而分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)以其卓越的識別性和選擇性，在環境、食品衛生、醫藥化工等眾多領域顯示出較好的應用前景［5］．如 Barahona等［6］合成噻苯咪唑分子印跡聚合物，用于固相萃取柑橘類水果和橙汁樣品中的噻苯咪唑;De Barros等［7］利用分子印跡聚合物分離測定西紅柿中殺螟松的殘留量．方繼敏等［8］采用溶脹聚合法制備了微囊藻毒素分子印跡聚合物，對MC-LR具有良好的吸附能力，本體聚合法制備分子印跡聚合物與溶脹聚合法相比具有實驗條件易于控制、制備工藝和設備簡單的優點而被廣泛應用［9－10］．但至今沒有本體聚合法制備微囊藻毒素分子印跡聚合物的相關報導．

本文以MC-LR為印跡分子，采用本體聚合的方法，制備微囊藻毒素分子印跡聚合物材料，并對其反應機理和吸附性能進行分析．

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

微囊藻毒素MC-LR標準樣品(E-LR-c100 microcystin LR≥95%by HPLC)，產地臺灣地區;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，AR)，Sigma公司;2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸(AMPSA，AR)，AJohnson Matthey Company;偶氮二異丁腈(AIBN，CP)，國藥集團化學試劑有限公司;鄰苯二甲基二甲酯(DMP，AR)，北京化學試劑公司;二甲基亞砜(DMSO，AR)，西隴化工有限公司．

Wsters－1525型高效液相色譜儀，美國沃特世公司;Avatar 370型紅外光譜儀FTIR，尼高力公司;TESCANVEGAⅡ型掃描電子顯微鏡，捷克 TESCANS．R．O 公司;HJ－3型恒溫磁力攪拌器，金坊市至翔科技儀器廠;ASAP2010M型比較面積與孔隙度分析儀，美國麥克儀器公司;KQ－400DB型數控超聲波發生器，昆山市超聲儀器有限公司．

1.2 微囊藻毒素分子印跡聚合物的制備

1.2.1 MIPs的制備

取 0.40 g 2-丙 烯 酰 胺-2-甲 基-1-丙 烷 磺 酸(AMSPA)、質量濃度為1.12 μg/mL的 MC-LR 3.0 mL放入50.0 mL的安培瓶中，加入3.0 mL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩30 min后，再加入引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)0.003 g、交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)4.0 mL，超聲混勻通入N2氣脫氧10 min后，真空密封，在70℃恒溫烘箱中反應6 h，得到塊狀固體MIP，經研磨、粉碎、過100目篩．

空白聚合物的制備除不加模板分子外，其他步驟相同．

1.2.2 印跡模板分子的洗脫

將所得粉末狀聚合物用1∶1的甲醇進行淋洗，再用含0.1%三氟乙酸的甲醇溶液超聲振蕩洗脫，洗去模板分子．真空室溫干燥至質量恒定后，即得到微囊藻毒素的分子印跡聚合物．空白印跡聚合物與印跡聚合物的洗脫方法相同．

1.3 分子印跡聚合物的表征

本實驗采用掃描電子顯微鏡觀察聚合物的微觀形態，孔隙度分析儀來表征聚合物的孔徑分布情況，并用紅外光譜儀研究聚合物的結構特征，用高效液相色譜法測定微囊藻毒素MC-LR的含量．

2 結果與討論

2.1 分子印跡聚合物的條件優化

2.1.1 不同單體模板比例的選擇

選擇功能單體與模板的比例是制備MIPs的關鍵一步，二者的比例對識別孔穴的產生具有很大影響，所以實驗取單體AMPSA與模板MC-LR的質量比分別為 0.2 × 107∶1，0.7 × 107∶1，0.9 × 107∶1，1.3×107∶1和2.2 ×107∶1進行聚合．通過聚合物的掃描電鏡圖及對藻毒素的吸附量，確定合成MIPs的最佳單體模板比例．掃描電鏡圖見圖1．

圖1 不同單體模板比例的MIPs掃描電鏡圖Fig．1 SEM for different monomers template proportion of MIPs

由圖1可以清晰地看出聚合物形態上的變化．單體與模板的比例較小時，形成的印跡點位不夠穩定，過多的模板阻礙了單體間的聚合，很難形成聚合物．當單體與模板的比例較大時，則單體之間容易直接聚合，產生分子包埋現象，質量比AMPSA∶MC=0.9 ×107∶1時相對較好．

單體AMPSA與MC-LR的質量比分別為0.2×107∶1，0.7 ×107∶1，0.9 ×107∶1，1.3 ×107∶1和2.2 ×107∶1時，制備的分子印跡聚合物對藻毒素的吸附量見圖2．由圖2可以看出，模板與單體質量比為0.9×107∶1時吸附量也最大;所以，單體模板的比例AMPSA∶MC=0.9 ×107∶1時為佳．

圖2 不同單體模板比例的MIPs對藻毒素的吸附量Fig．2 Adsorption quantity of MC for different monomers template proportion of MIPs

2.1.2 不同交聯劑用量的選擇

交聯劑能使模板分子和功能單體形成高度交聯、剛性的聚合物，從而形成更加穩定的印跡空穴．

不同交聯劑的使用對分子印跡聚合物形成的性質有顯著的差異，見圖3．當交聯劑用量較低時，生成的分子印跡聚合物網絡比較稀疏，交聯度較低，會使印跡空穴的穩定性降低，吸附選擇性變差;增加交聯劑的用量時，則交聯度變大，交聯產物有一定強度，可使印跡空位得到較好的保持，有利于獲得高效的印跡聚合物．但交聯劑用量過高時，孔隙度降低，形態不規則，且尺寸分布不均勻，聚合物粘結在一起，不利于吸附及洗脫．所以交聯劑模板的比例為1.2 ×106∶1時為佳．

圖3 不同交聯劑用量的MIPs掃描電鏡圖Fig．3 SEM for different crosslinking agent amount of MIPs

2.1.3 洗脫時間的選擇

模板分子MC-LR可溶于甲醇，本實驗分別用含0.1%三氟乙酸的甲醇來洗脫模板分子，這對其他反應物并無影響．洗脫時間分別用 5，10，20，25，30，40 min．隨后，對洗脫液進行液相色譜分析．當洗脫時間為25 min時，液相色譜已無MC檢測出，所以洗脫時間選用25 min為佳，見圖4．

圖4 MC-LR的質量濃度變化曲線Fig．4 Concentration change curve of MC eluent

2.2 合成分子印跡聚合物的優化配方

通過討論影響分子印跡聚合物的表觀及內在因素，在此基礎上確定合成MIPs的優化配方，見表1．

表1 本體聚合法制備分子印跡聚合物的優化配方Tab．1 Formulas for synthesis of MIPs by bulk polymerization

2.3 紅外吸收光譜圖解析

為證實模板分子MC-LR和功能單體AMPSA在引發劑AISN引發下的自組裝作用，本文通過紅外譜圖對比了含MC-LR的模板經洗脫后和空白模板聚合物的情況，見圖5．

從圖5可以看出，空白模板和洗脫微囊藻毒素印跡后的模板，峰型基本一致，說明印跡模板得到了較好的洗脫．在3 439.28 cm－1處為酰胺鍵中N—H的伸縮振動峰，1 720.90 cm－1附近為較強的C==O伸縮振動峰，表明經交聯聚合得到的聚合物存在可以同印跡分子作用的酰胺基官能團，在1 454.22 cm－1處的C==C雙鍵峰幾乎看不到，說明具有C==C的大部分交聯劑和功能單體都已在聚合過程中消耗．

圖5 空白模板和印跡模板洗脫后的紅外吸收光譜圖Fig．5 IR spectroscopy of blank templates and imprinting template after eluting

2.4 聚合物的微孔結構分析

所制得的MC-LR分子印跡聚合物是具有一定層次孔徑分布的多孔性聚合物，其孔徑范圍在3～86 nm，見圖6．其中孔徑小于20 nm的小孔占17.4%;20～50 nm的中孔占58.8%;孔徑50 nm以上的也有一定的分布，占總容積的23.8%．這些大孔的存在為溶劑的擴散提供了良好的空間，同時也是質量交換的重要場所．

圖6 分子印跡聚合物的孔徑分布Fig．6 Pore diameter distribution curve of MIPs

2.5 分子印跡聚合物形成機理的探討

根據模板MC-LR和單體AMPA的分子結構可以推測:該作用可能是氫鍵和離子鍵作用．根據分子印跡聚合物的制備原理過程，推測出微囊藻毒素MC-LR分子印跡聚合物的形成如圖7．

圖7 分子印跡聚合物形成過程示意Fig．7 Formation process of MIPs

印跡聚合物中形成了與模板分子MC-LR相互作用的結合位點，使印跡聚合物具有專一性、特異性識別等優點．MC-LR上的羧羥基是良好的氫鍵供體，而2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸上的C==O、S==O基和C==C基均為氫鍵的受體，—CH2上的一對孤對電子可以與相鄰的C==O形成共軛，而C==O上的O原子上有兩對孤對電子，具有較高的電子云密度，因此，C==O基團優先于 MC-LR上的—OH、—NH2形成氫鍵．

2.6 分子印跡聚合物的吸附性能

為了檢驗分子印跡的特異性吸附性能，其吸附是特異的分子印跡吸附而不是純物理吸附，本實驗比較了在優化條件下，分子印跡聚合物和空白印跡聚合物對不同濃度底物的吸附效果，如圖8．

圖8 有模板和空白模板分子印跡聚合物對模板分子的吸附量Fig．8 Adsorption capacities of template on MIPs and UMIPs

印跡聚合物吸附其模板分子MC-LR的能力遠遠大于吸附其同分異構體MC-RR的能力(見表2)，此處對MC-RR的吸附可看做是物理吸附，這也說明印跡聚合物對MC-LR的專一選擇性和特異識別性．分配系數是指洗脫模板后聚合物與空白模板聚合物的吸附量之比．

表2 有模板和空白模板分子印跡聚合物對不同底物的吸附效果Tab．2 Absorption effect of different sllbstrates on MIPs and UMIP

2.7 分子印跡聚合物的等溫吸附曲線及Scatchard模型分析

為了研究聚合物吸附性能的大小，在優化條件下，即溫度25℃，吸附時間為150 min，分別取0.10 g聚合物經洗脫、研磨、并過100目篩，然后放入5.0 mL各種不同濃度的MC-LR溶液中進行吸附實驗，等溫吸附曲線如圖9．在吸附過程中當MC-LR濃度過低時，聚合物表面的功能基團不能與印跡分子充分結合，平衡吸附量也較少．此時增加模板分子的濃度，則被功能基團結合的印跡分子的數量就增多，相應增加了產物表面的有效結合位點，從而增加其吸附性能．由圖9可知，當吸附達到平衡時，最大吸附量為 153.7 μg/g．

圖9 分子印跡聚合物的等溫吸附曲線Fig．9 Isothermal adsorption curve of MIPs

Scatchard模型廣泛用于受體結合動力學的研究．測定分子印跡聚合物在不同MC-LR濃度范圍內的吸附量，并對該聚合物進行Scatchard模型分析．Scatchard方程式如下:

式(1)中，Kd為結合位點的平衡離解常數，Qmax為結合位點的最大表觀吸附量．

將Q/Co對Q作圖(如圖10)，經線性回歸，得回歸方程:y=－0.2355x+36.695，相關系數R2=0.998 8，計算得離解常數 Kd=4.2 μmol/L，最大表觀吸附量 Qmax=153.7 μg/g．

圖10 MC-LR在分子印跡聚合物上的Scatchard曲線Fig．10 Scatchard curve of MC-LR on MIPs

3 結論

以MC-LR為印跡分子，AMPSA為功能單體，EGDMA為交聯劑，二甲基亞砜為溶劑，制備了MCLR分子印跡聚合物，并優化了聚合條件．并對分子印跡聚合物的機理進行了動力學的研究．為地表水飲用水源地中微囊藻毒素MC-LR的富集分離、固相萃取和檢測提供了一種新方法．對于防范藻毒素給環境及人類健康帶來的威脅，為飲用水安全保障提供技術支撐具有重要意義．

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(責任編輯:檀彩蓮)

Preparation and Performances of Molecularly Imprinted Polymer for Microcystins

SHEN Qing1， CUI Li-feng1， ZHAO Shuo2
(1．School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;2．Qinggong College，Hebei United University，Tangshan 063000，China)

The microcystins molecularly imprinted polymers(MIPs)were synthesized by bulk polymerization using microcystin(MC-LR)as the template，and the preparation process was optimized．The MIPs were characterized by electron microscopy，porosity analysis and FT-IR，and their reaction mechanism and adsorption performance were investigated．The results showed that the ratio of monomer，template，and crosslinking agent was 0.9 ×106∶1∶1.2 ×106，the adequate elution time was 25 min，and the maximum adsorption was 153.7 μg/g．The MIPs has a significant and specific adsorption to MC-LR．

microcystins MC-LR;molecularly imprinted polymers;bulk polymerization;adsorption performance

TS201.6

A

1671-1513(2012)03-0043-06

2011-10-21

北京市自然科學基金資助項目(2102015)．

申 晴，女，碩士研究生，研究方向為水環境分析;

崔莉鳳，女，教授，主要從事水環境問題方面的研究．通訊作者．