嗜溫乳酸菌與白地霉混合發酵酸乳的研究

高 鑫， 王昌祿， 陳勉華， 王玉榮， 李風娟

(天津科技大學食品營養與安全教育部重點實驗室/食品工程與生物技術學院，天津 300457)

嗜溫乳酸菌與白地霉混合發酵酸乳的研究

高 鑫， 王昌祿， 陳勉華， 王玉榮， 李風娟

(天津科技大學食品營養與安全教育部重點實驗室/食品工程與生物技術學院，天津 300457)

與高溫發酵酸乳相比，嗜溫乳酸菌與霉菌聯合發酵酸乳有更豐富的風味物質，且嗜溫發酵酸乳粘稠、細膩，香氣濃郁、純正，酸甜適口.采用編號為3-7和3-9的嗜溫乳酸菌與1株產香白地霉聯合發酵生產酸乳，通過混料試驗設計，得到酸乳發酵劑的優化菌種體積配比(乳酸菌3-7∶乳酸菌3-9∶白地霉)為50∶5∶45時，其風味、質地和氣味較佳.該酸乳具有很高的有效營養成分，其胞外多糖質量濃度高達643.2 mg/L，具有較高的生理功能.其中白地霉不僅能與乳酸菌互利共生產生真菌胞外多糖，而且其產生的香氣成分還能有效地提高呈香型物質的種類和含量，改善酸乳的風味質量.

嗜溫乳酸菌;白地霉;功能性酸乳;胞外多糖

隨著人們生活水平的不斷提高和健康消費觀念的加強，近年來圍繞風味優良、功能性顯著等方面開發的酸奶產品愈加受到消費者的歡迎［1－2］.目前，國內市場上的酸乳產品主要是以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為主要菌株發酵的高溫發酵酸乳［3］，品種單一，過分依賴增稠劑，乳化劑等食品添加劑來保持酸乳的質構特性.

嗜溫乳酸菌主要是最適生長溫度介于20～30℃的一類乳酸菌，最常見的是乳球菌和明串珠菌.研究表明，采用嗜溫乳酸菌發酵的酸乳風味柔和，在較低溫度下能產生更多的風味物質［4－5］，產胞外多糖能力更強［6－11］.

白地霉(Geotrichum candidum)是一種常見真菌，屬于半知菌亞門、叢梗孢科、卵形孢霉族、地霉屬［12］.白地霉細胞內含有豐富的蛋白質和脂肪，可供食用及飼用.據報道［13－17］，部分白地霉具有突出的產香能力，是一種具有應用潛力的工業微生物，國外普遍用它來生產乳酪［18－20］，國內多用食品工業廢棄物來發酵生產白地霉，作為菌體蛋白使用.

本研究擬利用篩選的2株嗜溫乳酸菌及1株能夠發酵牛乳產生胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)的產香白地霉進行混合發酵，在實驗室條件下制備富含胞外多糖的功能性酸乳，確定混合發酵酸乳的生產工藝并對其品質進行評價.

1 材料與方法

1.1 菌株

實驗用4 株乳酸菌(編號為 3-2，3-3，3-7，3-9)及白地霉均篩自新疆伊犁地區哈薩克族牧民自制傳統發酵乳制品.

1.2 儀器

DV-Ⅲ+型流變儀，美國 Brookfield公司;GC-2010型氣相色譜儀，日本島津公司;4000GC/MS型氣相色譜質譜聯用儀，美國瓦里安公司.

1.3 混料試驗設計軟件

本試驗中混料試驗的設計采用Design expert 8.0 軟件［21－22］.

1.4 方法

1.4.1 菌落計數

乳酸菌計數方法參見文獻［23］，霉菌計數方法參見文獻［24］.

1.4.2 EPS提取

用飽和NaOH調樣液pH值至8.0，4 000 r/min離心15 min，上清液用HCl調節pH值至4.6，3 000 r·min－1離心 15 min.調 pH 值至 7.5，加入 1/10 體積的胰酶液(質量濃度為3 g/L，現配現用)，40℃水浴酶解 2.5 h 后，2 000 r·min－1離心 15 min.加入1/3 體積的 Sevag液振蕩 30 min，3 000 r·min－1離心15 min，去除沉淀，重復3次.加入3～5倍體積的95%的乙醇，充分振蕩(多糖呈絮狀沉淀析出)，3 000 r·min－1離心 15 min，收集沉淀.洗滌干燥:將沉淀用丙酮洗滌脫水兩次，真空干燥得粗多糖.

1.4.3 粗多糖純度測定

采用苯酚－濃硫酸法測定胞外多糖含量，用葡萄糖作標準曲線.準確吸取葡萄糖標準溶液(1 mg/mL)，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.12 mL(相當于葡萄糖 0.0，50，60，70，80，90，100，120 μg)及各樣品備用液0.1 mL置于10 mL比色管中，用蒸餾水補足1.0 mL，分別加入1.0 mL 5.0%苯酚水溶液，搖勻后靜止2 min，迅速加入5 mL濃硫酸，靜止10 min，置于30℃水浴中保溫15 min，取出，置冷水中冷卻，以空白管為對照，用紫外分光光度計在波長490 nm處測定光密度.以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制標準曲線，計算胞外多糖含量.

1.4.4 白地霉揮發性香氣成分分析

采用氣相色譜－質譜聯用儀(GC-MS)對白地霉產生的揮發性風味物質進行測定.氣相色譜條件，色譜柱型號為 VF-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度為250℃，載氣為 He，99.999%，初始溫度40℃，保持3 min，以4℃/min，升至150℃，保持1 min，以8℃ /min，升至250℃，保持6 min.質譜條件的質量分離器為離子阱;離子源為EI;電離能量為70 eV;離子阱溫度為220℃;傳輸線溫度為280℃;溶劑延遲時間1 min.掃描方式為全掃描;掃描范圍為50～500 m/z;檢索譜庫為NIST05.

2 結果與分析

2.1 混料試驗對菌種比例的確定

發酵酸乳在一般情況下，接種量是一定的，最終發酵乳的產品特征指標與接種菌株比例有關.因此，混料回歸設計比較適合本實驗中菌種配比的研究.利用Design expert 8.0軟件進行混料試驗設計，初始參數設置見表1，軟件生成的混料試驗見表2.

表1 混料試驗參數設定Tab.1 Parameters of mixture design

表2 混料試驗Tab.2 Mixture design

通過Design Expert 8.0進行試驗設計，將試驗結果輸入軟件，通過對試驗數據的分析，軟件預測了優化后的菌種比例，并通過試驗對此比例進行驗證，最終確定采用2株乳酸菌(3-7和3-9)與白地霉按體積比50∶5∶45的比例(總接種量按5%接種)進行接種，在該條件下，發酵乳在質地及風味上都優于其他配比.經鑒定，菌株3-7為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus Lactis subsp.lactis)，菌株3-9為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus Lactis subsp.cremaris).

前期試驗數據顯示，乳酸菌3-7單菌發酵酸乳具有較好的風味，乳酸菌3-9單菌發酵酸乳具有較好的質地，且乳酸菌3-9是高產EPS菌株.白地霉除具有優良的產香特性外，也具有很高的產EPS能力.從最終優化的菌種配比中可以看出，只需較少量乳酸菌3-9即可使酸乳具有很好的凝乳效果，很少量白地霉即可改善發酵乳的氣味.

2.2 乳酸菌、霉菌聯合發酵酸乳工藝

2.2.1 聯合發酵酸乳工藝

乳酸菌3-7→30℃活化24 h→接種于5 mL無菌脫脂乳→約10 h凝乳;乳酸菌3-9→30℃活化24 h→接種于5 mL無菌脫脂乳→約6 h凝乳;白地霉→孢子懸浮液→接種于5 mL無菌脫脂乳→30℃，200 r·min－1，48 h;乳酸菌 3-7、乳酸菌 3-9 和白地霉以體積比50∶5∶45，按接種量5%接種于無菌全脂牛乳中，30℃培養12 h，4℃后發酵8 h，即得到產品.

2.2.2 菌落計數

為保證試驗的可重復性，有必要對接種時各個菌液的濃度進行測定，以確定接種時各個種子液中活菌的數目.測定結果:乳酸菌3-7為2.0×108個/mL，乳酸菌 3-9為 1.6×108個/mL，白地霉菌為9.3×106個/mL.

2.3 發酵乳特征指標檢測

2.3.1 黏度測量結果

采用流變儀.在4℃下測試黏度，轉子型號為RV5，分別在16 r/min的速度下測定3次，每15 s取值一次，每個樣品做兩個平行試樣，結果計算算術平均值.實驗測得發酵乳的黏度為8 600 mPa·s.

2.3.2 EPS含量的測定結果

按1.4.2和1.4.3方法，對乳酸菌3-7和3-9與白地霉單菌發酵所得酸乳以及乳酸菌霉菌聯合發酵所得酸乳進行EPS含量測定，結果見表3.表3顯示，乳酸菌3-9和白地霉發酵所得酸乳有很高的EPS含量，而乳酸菌與霉菌聯合發酵能促進酸乳EPS產量的進一步提高，所得發酵乳EPS含量高達643.2 mg/L，可賦予發酵乳更高的有效營養成分.

表3 發酵乳EPS含量Tab.3 Concentration of EPS

2.4 白地霉揮發性香氣成分分析

接種量按5%計，將乳酸菌3-7、乳酸菌3-9、白地霉按體積比50∶5∶45比例混合接種全脂牛乳，采用GC-MS測定其中風味物質，其結果如表4.

表4 白地霉產生的揮發性香氣成分GC-MS分析結果Tab.4 GC-MS results of volatile compounds of Geotrichum candidum

GC-MS共檢測到29種化合物，與乳酸菌3-7和3-9發酵所得酸乳相比，白地霉產生了12種新的化合物，其中酸類7種，酯類2種，醇類2種，醛類1種.從面積比來看，含量最高的是己酸正丙酯(47.91%)，其次是辛酸 (15.72%)、癸酸(13.56%)、月桂酸(8.172%)、丁酸(1.672%)，(R)-4-甲基己酸(1.226%).由此可見，白地霉所產揮發性風味物質主要為酯類及酸類.可有效提高酸乳中的呈香型物質的種類和含量，改善發酵乳風味.

3 結論

白地霉能發酵牛乳產生EPS，其質量濃度為341.6 mg/L.白地霉與乳酸菌3-7和3-9混合發酵酸乳，其EPS質量濃度可達643.2 mg/L.由于EPS的存在，該酸乳具有細膩粘稠的質構，呈現良好的凝膠穩定性，無需依賴食品添加劑賦予其粘稠、穩定的酸乳質構.

白地霉與乳酸菌3-7和3-9的最適發酵溫度均為30℃，是混合發酵酸乳的基礎.在發酵開始階段，白地霉消耗了發酵體系內的氧氣，為兼性厭氧的乳酸菌3-7和3-9提供了低氧的發酵環境.白地霉豐富的蛋白酶和脂肪酶將乳酸菌不能利用的大分子物質代謝，為乳酸菌的快速生長提供了良好的營養基礎.

對乳酸菌與白地霉的接種比例進行混料試驗，確定了乳酸菌3-7、乳酸菌3-9與白地霉的比例為50∶5∶45，在該配比下，所得發酵乳具有較佳的質地及風味.

通過GC-MS對白地霉所產揮發性風味物質的分析結果顯示，白地霉利用牛乳中進行脂肪代謝產生的揮發性風味物質主要為酯類及酸類，可有效地提高牛乳中的呈香型物質的種類和含量，改善發酵乳的風味.

本研究通過對嗜溫乳酸菌3-7和3-9與白地霉的混合發酵的初步研究，得到EPS含量高、風味、口感優良的發酵乳，可為今后功能性酸乳生產提供新的思路，通過進一步研究乳酸菌與霉菌間的相互作用，期望更深入了解其發酵機理，生產出優質的新型功能性酸乳.

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(責任編輯:葉紅波)

Study on Yogurt by Mixed Fermentation of Lactococcus Lactis and Geotrichum Candidum

GAO Xin， WANG Chang-lu， CHEN Mian-hua， WANG Yu-rong， LI Feng-juan
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education/School of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Compared with the high temperature fermented yogurt，mixed fermented yogurt has more volatile compounds and more favorable taste and flavor.In this study，the yogurt was produced by applying two Lactococcus Lactis strains and one Geotrichum candidum strain together.The optimal combination of strains was 50∶5∶45(v/v)，determined by mixture design.The yogurt has high concentration of exopolysaccharides(up to 643.2 mg/L)，which means its high functionality.Besides，the addition of Geotrichum candidum not only increased the EPS concentration in the yogurt，but also increased the types of aroma components and improved the flavor of the yogurt.

Lactococcus lactis;Geotrichum candidum;functional yogurt;exopolysaccharides

TS252.54

A

1671-1513(2012)03-0030-05

2012-01-31

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2006BAD04A06).

高 鑫，女，碩士研究生，研究方向為功能性發酵酸乳;

王昌祿，男，教授，博士生導師，主要從事食品生物技術方面的研究.通訊作者.