殼聚糖對Nisin抑菌穩定性的影響研究

曾清清，張立彥，劉啟蓮

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

乳鏈菌肽(Nisin)，是由屬于N型血清的某些乳酸鏈球菌(lactococcuslactis)在代謝過程中合成和分泌的具有很強殺菌作用的小肽，由34個氨基酸殘基組成［1］。目前，Nisin主要是作為食品防腐劑和抑菌劑在食品工業和醫藥業得到廣泛應用［2－3］。溫度和pH會顯著影響Nisin的活性［4］，在儲放過程中Nisin也在不斷失活，Nisin的這些特性都將限制其應用。因此有必要研究改善Nisin抑菌活性的措施或保護物質，從而提高其抑菌穩定性，延長其抑菌期限。殼聚糖(chitosan)是甲殼素經脫乙酰處理得到的生物大分子，可用于保護蛋白質等的生物活性，但尚未見有關于殼聚糖保護Nisin活性的報道。為此，本實驗研究了不同溫度和pH下殼聚糖對Nisin的保護效果，并結合紅外光譜和DSC的測定，進一步探討了其對Nisin活性的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤黃微球菌(Micrococcus luteus) CICC10209，廣州環凱微生物科技有限公司;Nisin 食品級，浙江銀象生物工程有限公司;殼聚糖 分析純，天津市華苑產業區鑫茂科技園。

Model 752型紫外可見分光光度計 上?，F科分光儀器有限公司;LDZX－30FA型手提式不銹鋼蒸汽消毒器 江陰頂江機械設備有限公司;DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司;BSD－150型水浴恒溫振蕩培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;Nicolet 560型紅外光譜分析儀 Nicolet Company;Q200型差式掃描量熱儀TA Company。

1.2 實驗方法

1.2.1 Nisin 效價的測定［5］

1.2.1.1 培養基的配制 斜面培養基:蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉 5g/L，瓊脂 20g/L，pH7.0;種子培養基:蛋白胨 5g/L，牛肉膏 3g/L，氯化鈉 5g/L，pH7.0;CM檢測培養基:Tween20與水(體積比1∶1)混合物2g/L，胰蛋白胨8g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氫二鈉2g/L，pH6.8。

1.2.1.2 培養方法 種子培養:藤黃微球菌菌種活化后接至斜面培養基，33℃培養1～2d，至斜面長好，將長好的斜面用無菌竹簽刮至100mL種子培養基中，33℃，150r/min搖床培養6h;檢測培養:將培養好的種子液以10%(體積分數)的接種量接至50mL CM檢測培養基中，加入適量經熱處理的Nisin溶液，33℃，150r/min搖床培養5h，測定Nisin效價，每個實驗做3個平行樣，取平均值。

1.2.1.3 Nisin效價的測定 分光光度法［5］。

1.2.1.4 效價損失率的計算:

式中:C1:未經處理時Nisin的效價;C2:經過處理后Nisin的效價。

1.2.2 處理方法

1.2.2.1 溶液的配制 Nisin標準溶液:準確稱取10mg Nisin標準品(103IU/mg)，溶于10mL 0.02mol/L HCl中，配制成103IU/mL Nisin標準溶液備用;殼聚糖溶液:準確稱取1.0g殼聚糖，加1%的冰乙酸溶液溶解定容至100mL，配制成10g/L的殼聚糖溶液。

1.2.2.2 殼聚糖存在情況下pH及溫度對Nisin抑菌能力的影響 在Nisin標準溶液中分別加入與Nisin質量的1%相當的殼聚糖溶液，分別調節至不同的pH(2.0、4.0、5.5、6.0、6.5、6.8)，然后分別在不同溫度(30、45、60、75、90、110、121℃)下保持 20min，測定其效價。

1.2.2.3 殼聚糖濃度對Nisin抑菌能力的影響 在Nisin標準溶液中分別加入與Nisin質量的0、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%相當的殼聚糖溶液，分別在常溫(pH2.0)、85℃ (pH4.0)、121℃ (pH6.5)下處理20min，測定其效價。

1.2.3 紅外光譜測定 取一定量樣品與KBr混合壓片，采用紅外光譜儀在掃描范圍為400～4000cm－1內進行光譜掃描，分辨率為4cm－1。

1.2.4 差式掃描量熱分析 稱量液體樣品(6±0.2)mg于鋁盒中壓片，用DSC對樣品進行測定，測定參數:掃描溫度范圍為 20～200℃，升溫速率為10℃·min－1，以 99.999% 高純氮氣作為載氣，流速25mL·min－1。

2 結果與討論

2.1 pH和溫度對Nisin抑菌穩定性的影響

由圖1可知，pH和溫度對Nisin的抑菌能力均有顯著影響。同一溫度下，Nisin效價損失率隨著pH的升高而升高;而同一pH下，Nisin效價損失率也隨著溫度的升高而升高，這表明Nisin溶液的抑菌能力隨著pH或溫度的不斷升高而不斷降低，其抑菌活性減弱。這可能是因為Nisin是由34個氨基酸殘基組成的多肽化合物，氨基酸殘基及其作為抗菌活性分子的二聚體或是四聚體的結構在高溫下遭到了破壞，從而影響了Nisin作用藤黃微球菌的效果。同時pH升高會使Nisin的溶解性和穩定性降低，影響Nisin活性中心上必需基團的解離程度，活性也隨之降低［6－7］。當溫度為 30℃時，隨著 pH 的不斷上升，其效價損失率由原來的26.2%升高至77%，說明pH顯著影響Nisin的活性，抑菌作用得到抑制，但還具有一定的活性;但當溫度為121℃，pH由2.0上升到7.0時，其效價損失率由原來的26.2%升高至100%，說明在高溫條件下處理，pH的升高將顯著影響Nisin活性，且可引起其完全失活，這可能是因為在高pH時，Nisin分子內部氫鍵斷裂，以其內部的脫氫殘基易發生反應形成多分子共聚物，同時高溫也促進了分子構象的變化，這與江蕓［4］的研究結果一致。

圖1 pH和溫度對Nisin抑菌能力的影響Fig.1 Effect of pH and temperature on the antibacterial activity of Nisin

2.2 殼聚糖對Nisin抑菌穩定性的影響

2.2.1 殼聚糖存在情況下pH和溫度對Nisin抑菌能力的影響 由圖2可知，在1%殼聚糖存在的條件下，Nisin的效價損失率隨pH的升高先保持不變而后逐漸升高。當溫度低于90℃時，在pH2.0～6.0的范圍內，Nisin效價損失基本保持不變，pH大于6.0后，Nisin效價損失隨著pH的升高而急劇升高;但在近中性pH時，殼聚糖的溶解度降低，進而對Nisin的保護作用也隨之降低。此外，添加1%殼聚糖后，在pH2.0、4.0、5.5時，溫度對Nisin的效價損失基本沒有影響。當pH6.0，溫度低于90℃時，Nisin由于受到殼聚糖的保護，效價損失不大，但當溫度大于90℃時，Nisin效價損失則隨著溫度增大而迅速增大。在近中性條件下(pH6.5、6.8)，溫度低于 80℃時，溫度對Nisin效價影響較小;但當溫度高于80℃時，Nisin效價損失則隨著溫度升高而快速上升，此時殼聚糖對Nisin的保護作用減弱。

圖2 添加殼聚糖時，pH和溫度對Nisin抑菌能力的影響Fig.2 Effect of pH and temperature on the antibacterial activity of Nisin with chitosan added

結合圖1～圖2可知，在殼聚糖存在的情況下，Nisin的效價損失率比未添加時總體都有大幅度的下降，說明殼聚糖的添加對Nisin的抑菌穩定性具有較顯著的保護作用。這可能是因為殼聚糖分子中含有多個親水性基團，分子空間大，能結合大量的水分，具有很強的吸水性，能優先與水結合，使得Nisin分子的溶劑化層水減少，進而導致溶劑化層表觀體積的減少，可移動性降低，使得Nisin分子結構結合得更加緊密，從而能夠抵御外界環境的影響，保護了Nisin 分子結構的構象穩定性［8－10］。

2.2.2 殼聚糖濃度對Nisin抑菌能力的影響 如圖3所示，隨著殼聚糖濃度的增加，Nisin的效價損失率呈現出逐漸降低的趨勢(pH2.0，常溫除外)。pH2.0、常溫條件下，Nisin的效價損失率基本保持在0%的水平。pH4.0、85℃的條件下，無殼聚糖添加時Nisin效價損失率為37.6%，當添加0.3%濃度的殼聚糖時，Nisin效價損失率顯著降低到4%，說明此時添加的殼聚糖對Nisin的效價起到了較大的保護作用;隨著殼聚糖濃度的繼續升高，Nisin的效價損失率也繼續降低，但趨勢變得平緩，到1%的濃度時，Nisin已經基本無效價損失。在高溫、中性條件下(121℃、pH6.5)，當殼聚糖濃度低于1%時，Nisin效價損失率隨著殼聚糖濃度的升高而降低，當殼聚糖濃度大于1%時，Nisin效價損失率隨著殼聚糖濃度的升高反而略有升高，這可能是由于殼聚糖濃度過高，溶液變得很粘稠，反而對菌體具有一定的保護作用，表現為Nisin的效價損失率升高。

表1 殼聚糖對Nisin紅外光譜的影響Table 1 Effect of chitosan on Infrared spectrum of Nisin

圖3 殼聚糖濃度對Nisin抑菌能力的影響Fig.3 Effect of the concentration of chitosan on the antibacterial activity of Nisin

2.3 殼聚糖對Nisin抑菌活性影響的機制研究

2.3.1 殼聚糖對Nisin紅外圖譜的影響 添加1%殼聚糖的 Nisin紅外圖譜如圖4(樣品均在 pH6.5，115℃下處理15min)所示。添加1%殼聚糖對Nisin紅外圖譜的變化如表1。

由圖4可知，添加了1%殼聚糖的Nisin紅外光譜圖中，除了A、B、C、D四個吸收峰外，出現了其他吸收峰，分別是C－O伸縮振動峰和C－H面向彎曲振動峰。而A、B、C、D四個吸收峰是液態水的吸收峰，說明在pH6.5，115℃下處理15min后，Nisin的活性基團受到破壞，活性已經完全喪失。而在添加了殼聚糖的Nisin紅外光譜圖出現了新的吸收峰，表明它與Nisin分子間存在比較強的分子間作用力，形成了C－O、C－H鍵的結合，與 Nisin分子形成了氫鍵，C－O、C－H之間的作用增強，從而保護了Nisin原有的分子結構和活性基團，對穩定Nisin的空間構象、提高其穩定性有著明顯的作用。

圖4 添加殼聚糖的Nisin紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of Nisin with chitosan added

由表1所示可知，O－H伸縮振動峰、O－H搖擺振動峰出現了右移，且均向低波數方向有較大的移動。說明殼聚糖與Nisin之間形成了氫鍵，分子間締合作用和水合作用增強。而氫鍵的形成能夠抑制pH和溫度對Nisin所帶來的負面影響，防止其結構受外界環境作用而遭受破壞。這種分子間的作用力增加了Nisin空間結構的穩定性。

2.3.2 殼聚糖對Nisin熱穩定性的影響 當添加了1%殼聚糖的 Nisin在pH4.0、85℃加熱20min后，其效價損失率分別由未添加時的31%降到了0.3%，說明殼聚糖對Nisin的穩定性有著極強的保護作用(圖1、圖 2)。由 DSC圖譜可知，經 pH4.0、85℃ 加熱20min后，Nisin的熱變性溫度由pH2.0、常溫下處理的172.78℃降至現在的152.13℃。其可能的機制是pH與熱處理相結合導致Nisin內部疏水基團更多暴露在外，Nisin的空間結構遭到破壞，影響到活性基團的作用效果［11］。而殼聚糖的加入將變性溫度提高到了177.62℃。表明其對Nisin空間構象的穩定性有著顯著的保護效果。殼聚糖的羥基能夠替代水分子，同Nisin分子的某些基團存在著氫鍵結合，且這種結合明顯地提高了Nisin分子的熱變性溫度。

圖5 不同條件處理20min后的Nisin差示掃描量熱譜圖Fig.5 Thermogram of Nisin in different conditions for 20min

3 結論

本實驗結果表明殼聚糖可以顯著改善Nisin的抑菌穩定性。在殼聚糖存在的條件下，Nisin的效價損失率隨溫度及pH的升高先保持不變而后顯著增加，在不同的溫度及pH條件下，其保護效果有所差異。殼聚糖濃度在1%時改善效果最好。紅外光譜分析顯示，添加殼聚糖的Nisin紅外光譜圖表明殼聚糖與Nisin分子形成了氫鍵結合，穩定了Nisin的構象。DSC圖譜分析顯示，添加殼聚糖可以提高Nisin的變性溫度，改善其熱穩定性，從而改善了其抑菌穩定性。

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