多重PCR法檢測與分析魚塘生態系統大腸桿菌的耐藥基因與整合子

梁思思，李珺嶠，石 磊，吳希陽，*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510600;2.暨南大學理工學院，廣東廣州510600)

大腸埃希氏菌(E.coli)俗稱大腸桿菌，是埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌，是環境中常見的菌［1］。在一定的條件下，某些血清型的大腸桿菌會引起人或者動物患上各種病，如引起禽類的腹膜炎、氣囊炎等疾病。隨著抗生素和抗菌藥物的大量開發，人們不恰當地使用抗菌藥物，使得大腸桿菌對抗生素的耐藥日趨嚴重。我國是世界上濫用抗生素最嚴重的國家，不合理使用抗生素的現象普遍存在，使得大腸桿菌耐藥性在巨大用藥壓力下逐漸增強［2－5］，從耐藥低水平到耐藥高水平，從單重耐藥到交叉多重耐藥的發展，這引起醫學界和社會的極大關注。細菌間基因的水平轉移是細菌多重耐藥性形成和廣泛傳播的重要原因。整合子介導的細菌耐藥機制，因能解釋耐藥基因的高效快速傳播而備受研究者關注。研究表明，細菌通過整合子系統，在整合酶作用下，不斷從周圍環境捕獲外來耐藥基因，從而使細菌具有耐藥性。整合子作為可移動基因元件，可捕獲和整合細菌的耐藥基因，在細菌耐藥性的傳播和擴散中起到了至關重要的作用［6－8］。通常以整合酶的存在與否判斷細菌內是否存在整合子。目前根據整合子中整合酶基因(intI)的不同，將已經發現的整合子分為六類，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子最常見［9］。在養殖業生產中，抗生素作為飼料添加劑來預防疾病和促進動物生長，這樣低劑量長期的使用，導致動物養殖環境中致病性大腸桿菌耐藥菌株大量產生，這些耐藥菌通過多種途徑進行傳播，或將其耐藥基因通過畜禽產品直接傳遞給人類致病菌，引起交叉耐藥，對人類的健康造成了嚴重威脅［10－11］。目前對臨床分離的大腸桿菌的耐藥基因和整合子攜帶情況分析和研究的報道很多，但國內外對來自整個魚塘生態系統的大腸桿菌耐藥基因和整合子的研究還比較鮮見。本文對165株來自魚塘生態系統的大腸桿菌攜帶耐藥基因和整合酶基因的情況進行了檢測，通過檢測整合酶基因的存在與否判斷大腸桿菌是否攜帶有整合子基因，并且分析魚塘生態系統中耐藥基因和整合子的流行狀況。

表1 整合酶引物Table 1 Primers of integrase

表2 PCR反應體系Table 2 PCR reaction system

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來源 165株菌，來自佛山南海某魚塘生態系統，包括鴨的腸道、鴨周邊生活環境的水體、土壤，魚的腸道、魚生活環境的水體、土壤。菌株接種，經過生化鑒定，再用大腸埃希菌鑒定引物uspA進行PCR檢測，最后確定為大腸桿菌;Mutiplex PCR Assay Kit、100bp marker 寶生物工程(大連)有限公司。

TC－25/H型基因擴增儀 杭州博日科技有限公司;6321ZJ604721型Mastercycler pro梯度PCR儀艾本德(中國)有限公司;凝膠成像儀 SERIALN;電泳儀 JNUYI。

1.2 實驗方法

1.2.1 模板制備 參考文獻［12］，用煮沸法制備PCR模板DNA。

1.2.2 PCR擴增 根據所需要檢測的19種耐藥基因序列分別設計具有相同或者相近退火溫度的引物，分為三組。19種抗生素耐藥基因為:sulI(磺胺)、SHV(β－內酰胺類)、CAT1(氯霉素)、dhfrV(甲氧芐啶)、FloR(氟甲砜霉素)、aadA(氨基糖苷類)、OXA(β－內酰胺類)、TEM(β－內酰胺類)、cmlA(氯霉素)、CITM(氨芐青霉素)、ereA(大環內酯類)、dhfrI(甲氧芐啶)、aac(3)－I(慶大霉素)、aphA－1(氨基苷類)、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV(阿普拉霉素)、FOXM。整合酶引物的設計參考文獻［5，13－14］。如表1 所示。

反應總體系如表2所示。整合酶檢測反應條件:94℃預變性5min，94℃變性30s，52℃ 退火0.5min，72℃2min，30個循環，最后 72℃ 延伸 7min。對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與討論

2.1 大腸桿菌耐藥基因多重PCR擴增結果

2.1.1 耐藥率分析結果 對165株來自魚塘生態系統的大腸桿菌進行19種耐藥基因分析，PCR結果顯示，帶有一種以上的耐藥基因的菌株有151株，陽性率為91.51%。165株大腸桿菌普遍攜帶氯霉素、β－內酰胺類TEM、氨基苷類aphA－1耐藥基因。其中氯霉素類cmlA的陽性率最高，在165株中有105株菌攜帶氯霉素類 cmlA耐藥基因，陽性率為63.64%，其次是β－內酰胺類TEM，有82株菌檢出攜帶β－內酰胺類TEM耐藥基因，陽性率為49.70%。氨基糖苷類中以鏈霉素耐藥基因陽性率最高，35.15%(58/165);頭孢類藥物耐藥基因的攜帶情況表現為對氨芐青霉素的耐藥基因攜帶率高，MOXM和CITM的陽性率分別為29.46%(33/112)，3.03%(5/165)。詳細結果如表3所示。

對不同來源的大腸桿菌進行分類別比較，其中TEM(β－內酰胺類)、cmlA(氯霉素)和 aadA(氨基糖苷類鏈霉素)在鴨腸、鴨水、鴨土、魚腸、魚水、魚土中都有檢出。TEM的檢出率分別為59.34%、25.00%、40.74%、40.00%、58.33%、20.00%;氯霉素 cmlA 的檢出率比較高，分別為 63.74%、100.00%、25.93%、90.00%、83.33%、20.00%;aadA(鏈霉素)的檢出率分別為 43.96%、10.00%、37.04%、50.00%、8.33%、20.00%。在鴨腸中，(氨基苷類)aphA－1攜帶率高達96.00%;在鴨水中，cmlA(氯霉素)攜帶率高達100%;在魚腸和魚水中dhfrl(甲氧芐啶)攜帶率均為100%。詳細結果如表4所示。

2.1.2 多重耐藥水平分析 對大腸桿菌進行多重PCR檢測結果顯示，本研究選用的大腸桿菌最多帶7種耐藥基因 (FloR、aadA、TEM、cmlA、aphA－1、MOXM、aac(3)－IV)，帶四種以上耐藥基因的菌株占46.05%，帶2、3、4、5 種耐藥基因的菌株分別有 31、35、47、18株，分別占總菌株數 18.79%、21.21%、28.48%、10.91%。在攜帶多重耐藥基因的菌株中，集中在攜帶2～5種耐藥基因。

表3 大腸桿菌19種耐藥基因檢測結果Table 3 Detection of 19 resistant genes of E.coli

表4 不同來源大腸桿菌耐藥基因檢出率(%)Table 4 Frequencies of resistant genes of E.coli from different sources(%)

2.2 大腸桿菌整合酶多重PCR擴增結果

選擇帶有四種耐藥基因以上的菌株(74株)的DNA作為模板，用多重PCR法擴增三類整合酶基因，快速篩選出陽性菌株，結果擴增出大小約為565、403bp左右的片段，與陽性對照確認為Ⅰ型整合酶基因和Ⅱ型整合酶基因。74株菌株中，檢出Ⅰ整合酶基因陽性菌株的有65株，檢出率為87.84%;Ⅱ型整合酶基因陽性菌株有8株，檢出率10.81%;1株為陰性。檢測中沒發現有攜帶Ⅲ型整合酶基因菌株。結果如圖1、表5所示。

不同來源的攜帶多種耐藥基因的大腸桿菌幾乎全部都攜帶有Ⅰ型整合酶基因，攜帶型Ⅱ整合酶基因的菌株全部來源于鴨腸。如表6所示。

表5 整合酶檢測結果Table 5 Test result of integrase genes

3 討論

3.1 細菌耐藥狀況越來越嚴峻，而且耐藥率、多重耐藥還有逐年上升的趨勢。大腸桿菌很容易產生耐藥性，從而使抗菌藥物藥效降低甚至消失。讓人擔憂的是，大腸桿菌的耐藥性呈進行性增長，這對于由于大腸桿菌感染引起的疾病的治療帶來潛在的危機。因此以對大腸桿菌的耐藥性調查以及對大腸桿菌耐藥機制進行研究具有重要的意義，從而為解決細菌耐藥問題提供理論基礎和實驗基礎［15］。目前，大多數的研究者都集中于臨床分離的大腸桿菌的耐藥性研究，對整個魚塘生態系統大腸桿菌耐藥基因和整合子攜帶情況的研究還鮮有報道。隨著抗生素在養殖業上的廣泛使用和環境中耐藥菌的增多，我們有必要對來源于養殖業的大腸桿菌耐藥基因的攜帶情況進行檢測和研究細菌耐藥傳播。

表6 不同來源大腸桿菌整合酶基因攜帶率Table 6 Frequencies of integrase genes of E.coli from different sources

圖1 整合酶基因PCR檢測結果Fig.1 PCR result of integrase genes

3.2 本實驗的165株大腸桿菌來自魚塘生態系統中的鴨腸、鴨水、鴨土、魚腸、魚水、魚土，對其進行19種耐藥基因(Sul1、SHV、CAT1、dhfrV、FloR、aadA、OXA、TEM、cmlA、CITM、ereA、dhfrl、aac(3)－1、FOXM、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV、aphA－1)的多重PCR檢測。PCR結果顯示，帶有一種以上的耐藥基因的菌株有151株，陽性率為91.51%。這表明大腸桿菌中普遍帶有耐藥基因，其中以氯霉素類、β－內酰胺類的耐藥基因居多。從多重耐藥水平來看，攜帶2種及2種以上耐藥基因的大腸桿菌比率為86.06%。在攜帶多重耐藥基因的菌株中，集中在攜帶2～5種耐藥基因。這些說明大腸桿菌的耐藥水平已經不再停留在低水平的耐藥水平了，向多重耐藥、交叉耐藥水平發展。再對帶有4種耐藥基因以上的菌株進行整合酶基因檢測，結果98.65%的菌株攜帶有Ⅰ型整合酶基因或Ⅱ型整合酶基因，沒有檢出Ⅲ型整合酶基因。其中Ⅰ型整合子酶基因檢出率高達87.84%?？梢姡谡献咏閷У哪退帣C制中，以Ⅰ型整合子為主。

3.3 Ⅰ類整合子的存在與否明顯影響著大腸桿菌的耐藥性和多重耐藥率、耐藥譜，是基因水平監測多重耐藥性的重要指標［13－14，16－17］。魚塘生態系統中的鴨腸，鴨水，鴨土，魚腸，魚水，魚土中都檢測出攜帶有耐藥基因和整合子。這說明在這個魚塘生態系統中，攜帶耐藥基因和整合子的菌株普遍都有分布，而多重耐藥大腸桿菌株中整合子基因又普遍存在。因此整合子可能是誘發大腸桿菌多重耐藥的重要原因，并且耐藥基因通過整合子可移動的特點向周圍環境傳播，從而使得周圍環境的菌株產生多重耐藥、交叉耐藥。

4 結論

對魚塘生態系統及其周圍環境進行取樣檢測后發現，周圍的環境中的菌株都不同程度地攜帶有耐藥基因和整合子酶基因。其中攜帶多重耐藥基因的菌株中，Ⅰ類整合酶基因的占大多數。耐藥基因可能通過整合子的整合作用向周圍環境擴散，使得周圍環境的菌株出現不同程度地耐藥基因增多。

［1］AIIBOYE R M，SOLBERG O D，LEE B M，et al.Glob－al spread of mobile antimicrobial drug resistance determi－nants in human and animal Escherichia coli and Salmo－nellastrains causing community－acquired infections［J］.Clin Infect Dis，2009，49(3):365－371.

［2］齊云.淺談細菌耐藥及幾點預防建議［J］.基層醫學論壇，2010(14):92.

［3］金升藻，金巍，葉微.大腸桿菌耐藥性研究進展［J］.上海畜牧獸醫通訊，2008(6):17－18.

［4］Wang Xiu－mei，Jiang Hong－xia，Liao Xiao－ping，et al.Antimi－ crobial resistance，virulence genes and phylogenetic backgroundin Escherichia coli isolates fromdiseased pigs［J］.Fed Eur Microbiol Soc，2010，306:15－21.

［5］DAVID C B，DAVID M L，LUCINDA M C.Plasmids imparting sul－fonamide resistance in Escherichia coli:implications for persistence［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(3):1088－1093.

［6］Peng C F，Lee M F，Fu H T，et al.Characterization of class 1 integrons and antimicrobial resistance in CTX－M－3－producing Serratia marcescens isolates from southern Taiwan［J］.Japanse Journal of Infectious Diseases，2007，60(5):250－256.

［7］文道林.大腸埃希菌Ⅰ類整合子與耐藥性分析［J］.中國誤診學雜志，2009，15(9):3538－3540.

［8］Gu B，Pan S，Wang T，et al.Novel cassette arrays of integrons in clinicals trains of Enterobacteriaceae in China［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2008，32(6):529－533.

［9］SHAHEEN B W，OYARZABAL O A，BOOTHE D M.The role of class 1 and 2 integrons in mediatingantimicrobial resistance among canine and feline clini－cal E.coli isolates from the US［J］.Vet Microbiol，2010，144(3):360－370.

［10］Harada K，Asai T.Role of antimicrobial selective pressureand secondaryfactorson antimicrobialresistance prevalence in Escherichia coli from food－producing animals in Japan［J］.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2010，2010:1－12.

［11］Wierup M.The control of microbial diseases in animals:alternatives to the use of antibiotics［J］.Int J Antimicrob Agents，2000，14(4):315－319.

［12］羊云飛.多重PCR檢測沙門氏菌、大腸桿菌對磺胺類、氯霉素類藥物耐藥基因的研究［D］.成都:四川農業大學，2004.

［13］Lee M F，Peng C F，Hsu H J，et al.Use of inverse PCR for analysisof class 1 integrons carrying an unusual 3'conserved segmentstructure［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(2):943－945.

［14］Shaheen B W，Oyarzabal O A，Boothe D M.The role of class 1 and 2 integrons in mediating antimicrobial resistance among canine andfeline clinical E.coli isolates from the US［J］.Vet Microbiol，2010，144(3－4):363－370.

［15］Gillings M，Boucher Y，Labbate M，et al.The evolution of class 1integrons and the rise of antibiotic resistance［J］.J Bacteriol，2008，190(14):5095－5100.

［16］Partridge S R，Tsafnat G，Coiera E，et al.Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons［J］.FEMS Microbiol Rev，2009，33(4):757.

［17］范建華，卜仕金，徐步.禽源大腸桿菌多重耐藥性與I類整合子的關系［J］.江蘇農業科學，2010(5):298－300.