超高壓加工對菊糖果糖轉移酶活力和構象的影響

劉 苗，繆 銘，張 濤，張 瑜，江 波

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

超高壓加工(High Pressure Processing，HPP)技術是一種新型非熱加工技術，可應用于食品殺菌、鈍酶及食品保鮮等方面［1－2］，還可應用于蛋白質和淀粉等生物大分子的結構研究［3］。隨著超高壓加工在理論和技術方面研究的不斷深入，有關壓力處理對酶影響的研究越來越多。相關研究表明超高壓加工不僅能鈍化酶，也可將酶激活并提高酶的穩定性和活力［4］，但國內外當前對超高壓在激酶方面研究還相對較少。一般低壓(小于300MPa)處理對酶有激活作用(激酶效應)，高壓(大于300MPa)可鈍化酶［5］。低壓可使維持酶二級和三級結構的各種非共價鍵(如氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水相互作用等)更穩定或使酶活性位點發生變化而有利于底物的結合，而高壓可破壞酶的各種非共價鍵導致酶構象改變，酶活力隨之改變［6］。菊糖果糖轉移酶(Inulin Fructotransferase，即 IFTase，EC4.2.2.18)能從菊糖的非還原性末端裂解出兩分子果糖并使其脫水形成類環狀二糖酐——雙果糖酐III［7］。雙果糖酐III(Difrucose anhydride III，DFA III)是一種新型的天然功能性甜味劑。國內當前僅有本實驗室對A.aurescens SK8.001產菊糖果糖轉移酶的酶學性質及分子生物學方面和DFA III酶法合成進行了研究［7］。由于適當的提高壓力對菊糖果糖轉移酶有激活作用，因此本研究以菊糖果糖轉移酶為研究對象，運用熒光光譜和圓二色譜等方法研究壓力處理后菊糖果糖轉移酶構象的變化，并結合酶活力的變化，分析壓力處理后的酶構象變化與酶活力大小之間的聯系，為超高壓加工技術在激酶方面的研究提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

菊糖果糖轉移酶 實驗室自制;DFA III標準品 和光純藥工業株式會社;菊糖 比利時Beneo－Orafti公司。

超高壓儀器 S－FL－085－09－W 英國 Stansted Fluid Power公司;高效液相色譜儀Agilent 1100 美國安捷倫公司;圓二色譜儀MOS－450 AF－CD 法國Biologic公司;熒光光譜儀F－7000 FL 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菊糖果糖轉移酶活力檢測 菊糖2%1mL，100mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液和適量的酶液，總體積2mL，60℃水浴 15min后，沸水浴 10min滅酶。HPLC法測定DFAⅢ的生成量(Sugarpak1鈣型陽離子交換柱;柱溫:85℃;流動相:超純水(經0.22μm膜過濾);洗脫流速:0.4mL/min;上樣體積:10μL;檢測器:示差折光率檢測器)。

酶活定義:在 60℃，pH5.5條件下，1min產生1.0μmol DFAⅢ所需的酶量為 1個酶活力單位(U/mL)。未經處理的原酶液(未處理組)的相對酶活力為100%。

1.2.2 不同壓力對菊糖果糖轉移酶的影響 在80℃條件下，將酶液分別在 0.1、100、150、200、250、300、350、400MPa下處理10min，卸壓后立即進行光譜檢測及酶活力測定。

1.2.3 不同保壓時間對菊糖果糖轉移酶的影響 在80℃條件下，將酶液在0.1MPa和200MPa下分別處理 10、20、30、40、60min，卸壓后立即進行光譜檢測及酶活力測定。

1.2.4 熒光光譜檢測 激發波長為286nm，掃描范圍300～400nm，掃描速度為12000nm/min，狹縫寬度為5nm，PMT電壓為400V，室溫下重復掃描3次。空白為100mmol/L、pH5.5的醋酸鈉緩沖液，熒光強度值為扣除空白后的相對值。未處理組的相對熒光強度為100%。

1.2.5 圓二色譜檢測 以100mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液為空白，比色皿厚度0.1cm，掃描范圍190～250nm，室溫下重復掃描3次，掃描速度30nm/min。圓二色性用平均殘基橢圓值［θ］·10－5表示，單位為deg·cm2/dmol。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析

在酶蛋白分子中，色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸(Phe)這三種芳香族氨基酸由于側鏈生色基團的不同而有不同的熒光強度，Phe、Tyr、Trp的相對熒光強度分別為0.5、9和100，而Phe殘基在一般情況下很難被激發，因此酶的內源熒光主要由Trp和Tyr產生。Tyr熒光光譜最大發射波長一般位于303nm左右，由于Trp殘基對微環境的變化很敏感，導致其峰位多在325～350nm之間變動［8］。菊糖果糖轉移酶是一種單體酶，其氨基酸序列中有9個Tyr殘基和2個Trp殘基。壓力處理通過影響非共價鍵可改變酶的三級結構，現運用內源熒光光譜來研究壓力處理后酶三級結構的變化。

如表1所示，當激發波長為286nm時，壓力處理前后的酶最大發射峰位在343～353nm范圍內變動，這表明菊糖果糖轉移酶的內源熒光主要來自Trp殘基，這可能是由于酶分子的Tyr殘基到Trp殘基之間發生了能量轉移，從而導致Tyr殘基的熒光淬滅和Trp殘基的熒光增強［9］，由此推斷菊糖果糖轉移酶屬于B類蛋白，其內源熒光光譜實際上是Trp殘基的熒光光譜。壓力處理后的酶結構變化運用酶內源熒光光譜檢測，即表現為壓力處理后Trp殘基微環境變化。

表1 不同壓力對菊糖果糖轉移酶熒光峰位及熒光強度和酶活力的影響Table 1 Effect of different pressure on the fluorescence peak/intensity and IFTase activity

未經處理的原酶液(未處理組)的最大發射峰位在343.4nm，最大熒光強度為531.4，經常壓80℃處理后，與未處理組相比，酶活力和熒光強度均降低了12%左右。但經100、150、200MPa的壓力處理后其相對酶活力分別提高了8%、5%和9%，這表明適當的提高壓力不僅可抵抗酶的熱失活，而且使酶的催化活力增強，其原因是高溫使酶分子結構變的不穩定而導致酶活降低，而壓力處理能維持酶結構的微觀有序性［10－11］，使酶結構趨于穩定以抵抗酶的熱失活;同時，熒光峰位發生一定程度的紅移，最大發射峰的波長增大了2～3nm，與未處理組相比，最大熒光強度增加了1%左右，表明壓力處理后酶結構的變化導致一定數量的Trp殘基外露，導致熒光峰位紅移和熒光強度增強，因而可以利用熒光強度和峰位的變化的來反映壓力引起的Trp殘基微環境的變化。隨著壓力的繼續增大，峰位的紅移也更加明顯，但酶活力和熒光強度均逐漸降低，當壓力達到400MPa，酶活僅殘余7.8%，最大峰位紅移約10nm，相對熒光強度僅有66.88%，這表明過高的壓力(大于300MPa)明顯破壞了該酶的三級結構，使酶嚴重失活。如圖1所示，各壓力處理后的相對酶活力和相對熒光強度之間呈較好的線性正相關(R2=0.9896)。以上結果表明酶活力變化與壓力引起的Trp微環境的變化有緊密聯系。

圖1 各壓力(100～400MPa)處理后的相對酶活力與相對熒光強度之間的相關性Fig.1 Correlation between relative enzyme activity and relative fluorescence intensity under different pressure(100～400MPa)

由表2分析可知，200MPa下，隨著保壓時間的延長，酶活逐漸升高，在保壓30min時相對酶活力達最大，為124.08%，繼續延長保壓時間，酶活又逐漸降低，當保壓時間為 60min時，相對酶活力僅有73.27%。與酶活力隨保壓時間變化的趨勢類似，熒光強度也是隨著保壓時間的延長先升高再降低。其原因可能是壓力處理足夠的時間所帶來的能量可導致維持酶蛋白分子結構的一些相互作用力(如氫鍵作用、疏水性作用、范德華力等)發生適當的變化，這些變化導致酶三級結構的變化［12］進而熒光強度增強和酶活力提高;但過長的保壓時間會使過量的水分子滲透到酶分子內部，導致非極性基團的接觸減少而引起酶結構部分展開［12］，酶活力和熒光強度隨之降低。

表2 不同保壓時間對菊糖果糖轉移酶熒光峰位及熒光強度和酶活的影響Table 2 Effect of different dwell time on the fluorescence peak/intensity and IFTase activity

如圖2所示，壓力處理后菊糖果糖轉移酶的相對酶活力與相對熒光強度之間呈較好的線性正相關(R2=0.9976);而隨著常壓高溫處理時間的延長，相對酶活力逐漸降低，熒光強度則逐漸升高，其相對酶活力與相對熒光強度之間呈線性負相關(R2=0.9328)。Mozhaev等［13］認為酶熱失活的初始步驟是必要水分子的大量流失而導致結構重排，適當的壓力處理則通過電荷基團和非極性基團的水化作用來阻止這一過程，過高的壓力會迫使水分子進入蛋白質分子內部而引起蛋白質的部分展開。這表明雖然高壓和高溫處理都可改變酶的三級結構，但其機理明顯不同。

圖2 200MPa/0.1MPa處理不同時間后的相對酶活力與相對熒光強度之間的相關性Fig.2 Correlation between relative enzyme activity and relative fluorescence intensity at different time under 200MPa/0.1MPa

2.2 圓二色譜分析

由于包含發色團的酶蛋白分子的不對稱性，引起左右兩圓偏振光具有不同的光吸收的現象，即圓二色性(circular dichroism，CD)，常用于溶液中酶二級結構的研究。

運用圓二色譜分析壓力對菊糖果糖轉移酶二級結構的影響，結果如圖3所示。未經處理的菊糖果糖轉移酶的圓二色譜在219nm左右單有一個負峰，表明菊糖果糖轉移酶的二級結構以β－折疊為主。經壓力(100～400MPa)處理后，負峰的峰型和峰位基本未變(見圖3和表3)，說明在實驗壓力處理后菊糖果糖轉移酶的主體二級結構未發生很明顯變化。有文獻報道［14］酶二級結構的改變發生在非常高的壓力條件(高于300～700MPa)下，還依賴于壓縮速率和二級結構重排的程度，而這可導致酶的變性。本研究是在壓力(100～400MPa)處理后檢測酶二級結構的變化，實驗結果出現負峰值隨壓力的升高而逐漸升高，說明其二級結構發生了微小的變化，但當處理壓力大于300MPa，即使是這微小的變化也會導致酶的嚴重失活。在100～400MPa的壓力范圍內酶活力與219nm負峰值大小呈線性負相關(R2=0.9659)，如圖4，表明β－折疊是菊糖果糖轉移酶發揮催化活力的結構基礎。

圖3 各壓力處理后的菊糖果糖轉移酶的圓二色譜圖Fig.3 CD of the IFTase under the different pressure

表3 不同壓力對菊糖果糖轉移酶圓二色性和酶活力的影響Table 3 Effect of different pressure on circular dichroism and IFTase activity

圖4 各壓力(100～400MPa)處理后的相對酶活力與219nm處的負峰值之間的相關性Fig.4 Correlation between relative enzyme activity and value of the negative peak at 219nm under different pressure(100～400MPa)

圖5 不同處理時間后的菊糖果糖轉移酶的圓二色譜圖Fig.5 CD of IFTase under the different dwell time

由圖5(a)可知，與未處理組相比，219nm處的負峰值隨保壓時間的延長逐漸增大，相對酶活力則呈先上升后下降的趨勢，200MPa處理30min可使酶活提高最多(見表4)，而此時酶的二級結構與酶在自然狀態下的二級結構不同。處理時間超過30min后，酶活則開始降低，且219nm處的負峰值變化較大，這表明保壓時間過長使酶二級結構發生的變化可導致酶活降低。圖5(b)是常壓80℃處理10～60min后酶的圓二色譜圖，由圖可知，219nm處的負峰值變化不大，但酶活力損失較多，說明高溫處理10～60min可能對該酶的二級結構影響不大，而酶的部分熱失活可能與酶的三級結構(由酶的熒光光譜的結果可知)被破壞有關。

表4 不同保壓時間對菊糖果糖轉移酶圓二色性和酶活的影響Table 4 Effect of different dwell time on circular dichroism and IFTase activity

3 結論

在80℃的條件下，壓力處理后的菊糖果糖轉移酶的相對酶活力均隨著壓力的升高和保壓時間的延長呈先上升后下降的趨勢，在壓力為200MPa、保壓時間為30min時相對酶活力達最大，表明適當的壓力處理能增強酶的催化活力。菊糖果糖轉移酶的內源熒光吸收主要來自Trp殘基，并結合壓力處理后該酶的相對酶活力和相對熒光強度之間呈線性相關的分析，可知酶活力變化與壓力處理后Trp微環境的變化有一定聯系。由圓二色譜的結果可知β－折疊是菊糖果糖轉移酶的主要二級結構，219nm處的特征負峰值大小與相對酶活力呈負線性相關，表明β－折疊是該酶發揮催化活力的結構基礎。超高壓加工可提高菊糖果糖轉移酶活力，與壓力處理后酶二級和三級結構的變化有關，為超高壓加工提高酶活力的機理研究提供一定的理論依據。

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