瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝的研究

巴媛媛，樸美子，孟菡妍

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝的研究

巴媛媛，樸美子*，孟菡妍

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

為優化瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝，在單因素試驗的基礎上，以提取溫度、提取時間、水料比3個因素為自變量，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率為響應值，使用BOX-Benhnken中心組合試驗和響應面分析法，優化瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝，并確定瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的最佳工藝條件為：提取溫度80.99℃、提取時間2.13 h、水料比32.06∶1（mL/g）。在此條件下，實際提取率為10.49%，與預測值基本吻合。

瓦尼木層孔菌；多糖；提取工藝；響應面分析

瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii Ljub），又名楊黃，隸屬擔子菌綱、非褶菌目、銹革孔菌科、木層孔菌屬[1]。瓦尼木層孔菌以生長在天然林中老齡的楊樹上，且子實體孔口表面呈黃色、菌蓋邊緣為黃色帶狀環紋而得名[2]，人工林中很難找到。該菌具有抑制腫瘤、解毒、補腎、增強人體免疫力、防治癌癥等功效。近幾年，對瓦尼木層孔菌的馴化栽培已經獲得成功[3-5]，但是關于瓦尼木層孔菌活性物質提取的研究相對較少，尤其沒有與其多糖相關的報道。

本試驗主要利用瓦尼木層孔菌液體發酵所得的菌絲體為原料，采用熱水浸提法提取菌絲體多糖[6-7]，用苯酚-硫酸法[8]測定多糖含量，以菌絲體粗多糖提取率為指標，在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法[9-10]對瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝條件進行優化，為新型真菌多糖產品的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓦尼木層孔菌：青島農業大學中韓食品生物技術研究所。

葡萄糖、無水乙醇、乙醚、丙酮、濃硫酸、苯酚等（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

IS-RDH1恒溫振蕩器：美國精騏有限公司；SWCJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；BCD-216YH海爾冰箱：海爾集團；DU-800紫外分光光度計：美國Beckman公司；分析天平：奧豪斯公司；TGL-16C臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；YXQ-LS-SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精弘試驗設備有限公司；RE-52B旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；一列二孔電熱恒溫水浴鍋：龍口市先科儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

準確稱取一定質量的瓦尼木層孔菌菌絲體干粉→脫脂→熱水浸提→離心→上清液→脫蛋白→濃縮→醇沉→離心→沉淀→依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→60℃烘干→瓦尼木層孔菌菌絲體粗多糖

1.3.2 瓦尼木層孔菌菌絲體多糖含量的測定

用葡萄糖標準品通過苯酚-硫酸法制備標準曲線，得回歸方程A=0.0181C+0.0006[C為葡萄糖質量濃度，（μg/mL），A為吸光度]，R2=0.9999，線性范圍0～54μg/mL。同樣測定樣品提取液中多糖的吸光度，通過回歸方程計算瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的含量。

1.3.3 多糖提取率的計算

1.3.4 瓦尼木層孔菌菌絲體多糖水提工藝的優化

試驗選用提取溫度、提取時間和水料比對多糖提取率起主要影響的3個因素，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率為指標，進行單因素考察。在單因素試驗結果基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，設計三因素三水平的響應面試驗設計，因素見表1。

表 1 響應面分析因素與水平Table 1 Variables and levels in responses surface design

試驗共有15個試驗點，其中12個為分析因子，3個為零點。零點試驗3次，以估計誤差。數據用Design expert7.0程序進行分析，并由此得出響應面分析圖和方差分析表。進而得出模型方程，通過對模型方程的分析，得出最佳的菌絲體多糖提取工藝條件。

2 結果與討論

2.1 提取溫度對瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的影響

固定水料比20∶1（mL/g），提取時間2 h，提取次數3次，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取率為指標，考察不同的提取溫度對多糖提取率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，在提取溫度小于80℃時，瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率隨溫度的升高而升高；當溫度大于80℃以后，多糖提取率隨溫度的升高而降低，這可能是由于高溫條件下多糖結構遭到破壞的結果。因此，選擇提取溫度在80℃左右。

2.2 提取時間對瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的影響

固定水料比20∶1（mL/g），提取溫度80 ℃，提取次數3次，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取率為指標，考察不同的提取時間對多糖提取率的影響，結果見圖2。由圖2可知，多糖提取率隨著提取時間的延長，呈現先上升再下降的總體趨勢，但超過2 h時多糖提取率雖然有所增加但不明顯。并且提取時間過長，部分多糖分解從而造成損失，因此，選擇提取時間在2 h左右。

2.3 水料比對瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的影響固定提取溫度80℃，提取時間2 h，提取次數3次，

以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取率為指標，考察不同的水料比對多糖提取率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，當提取水料比為10∶1～30∶1（mL/g）時，隨著料水比增加其瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率逐漸增大，當水料比大于30∶1（mL/g）時多糖提取率有逐漸下降，因此，選擇水料比在30∶1（mL/g）左右。

2.4 瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝的響應面優化為了擬合多元二次模型方程各項系數的最優值，

根據Box-Behnken試驗設計要求，對影響多糖提取率的關鍵因素進行15組試驗，其中12組為分析因子，3組為零點。零點試驗3次，以估計誤差，其結果見表2。

表 2 響應面分析方案及結果Table 2 Process variables and levels in response surface design arrangement and experimental response values

通過對該數據進行二次多項擬合，獲得多糖提取率對提取溫度、提取時間和水料比的多元回歸方程：

表 3 方差分析表Table 3 Variance analysis for yield of polysaccharises with various extraction conditions

由表3可知，試驗所選用的模型高度顯著，擬合度好，預測值與實際值之間具有高度的相關性（R2=0.9871）。

由表4的Prob>F值可以看出，在所選的各因素水平范圍內，對結果的影響排序為：水料比>提取溫度>提取時間。且模型的復相關系數R2為98.71%，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型是合適的。因此可以用該模型方程來分析和預測不同條件下瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的變化。

圖4～圖6反映了各因素對響應值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。比較3組圖可知，三因素對瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率都有顯著的影響，水料比（X3）的影響為最顯著，表現為等高線更為陡峭；提取溫度（X1）和提取時間（X2）次之，表現為等到線曲線較平滑，說明兩者對響應值影響較小。

表 4 回歸分析結果Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

2.5 回歸模型的驗證

通過上述多元回歸方程優化得出Box-Behnken實驗的編碼值分別為X1=0.1976，X2=0.2526，X3=0.4130，所對應的瓦尼木層孔菌菌絲體多糖理論最佳提取條件為提取溫度80.99℃、提取時間2.13 h、水料比32.06∶1（mL/g）時，其提取率最高可達10.51%。根據此條件，進行實驗室重復驗證試驗，測得其抑制率最高可達10.49%，與理論值較為接近。結果證明，該模型準確，適用于瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝的優化。

3 結論

本文在單因素試驗基礎上，運用響應面法優化了瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取條件，最終得出菌絲體多糖最佳理論提取條件為提取溫度80.99℃、提取時間2.13 h、提取水料比32.06∶1（mL/g）。在此條件下，其瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率最高可達10.49%。與理論值10.51%較為接近。

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Study on Extraction Technology of Polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub

BA Yuan－yuan，PIAO Mei－zi*，MENG Han-yan
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In this study，optimum condition of extraction of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub was optimized by response surface test.On the basis of single－factor test，the mathematical regression model was established on the dependent variable（extraction yield of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub）and independent variables （extract temperature，extract time，water/material ratio）by Box－Benhnken center composite design and response surface methodology.The optimum extraction conditions were as follows：extract temperature 80.99 ℃，extract time 2.13 h，water/material ratio 32.06∶1 （mL/g）.Under these conditions，the yield of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub was 10.49%，consistent with the prediction value.

Phellinus vaninii Ljub；polysaccharides；extraction technology；response surface analysis

巴媛媛（1984—），女（漢），碩士，研究方向：農產品加工與貯藏。

*通信作者：樸美子（1966—），女（朝鮮），副教授，理學博士，研究方向：功能食品的開發。

2011-06-24