均勻設計法優化羅非魚肉富肽酶解液制備工藝

韓道財，洪鵬志，*，楊萍

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524025；2.廣東省高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524025）

均勻設計法優化羅非魚肉富肽酶解液制備工藝

韓道財1，2，洪鵬志1，2，*，楊萍1，2

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524025；2.廣東省高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524025）

為得到高肽含量羅非魚肉酶解液，以水解度及肽含量為指標，從胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase 2.4L、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶中篩選出中性蛋白酶為最適用酶。在單因素試驗的基礎上，采用均勻設計試驗優化中性蛋白酶酶解條件。得到最高肽含量酶解條件為：加酶量1.38%，料液比1∶3（g/mL），溫度50℃，自然pH，時間7 h，此時肽含量（以每克魚肉計）為（37.71±0.11）mg。

羅非魚；酶解；均勻設計；肽含量；水解度

羅非魚原產非洲，又名非洲鯽魚，屬鱸形目、麗魚科、羅非魚屬。羅非魚食性雜，繁殖能力強，味道鮮美，是聯合國糧農組織向世界推薦的優良養殖魚類之一[1]。我國是羅非魚養殖大國，2010年產量約為120萬t[2]，廣東省產量約占全國的1/2。目前，羅非魚加工產品主要是凍羅非魚片[3]，技術含量不高、附加值低。酶解魚蛋白可以得到生物活性肽[4-6]及具有優良吸收性的小肽[7]，羅非魚肉酶解液具有抗氧化[8-9]、降血壓[10-11]等生物活性。有研究者[12-13]以肽含量為指標對酶解羅非魚肉進行了研究，均以三氯乙酸-雙縮脲法測肽含量。本實驗采用超濾-雙縮脲法測定肽含量，以肽含量為主要指標，優化酶解羅非魚肉制備高肽含量酶解液的工藝參數，以期為羅非魚肉高值化加工與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

羅非魚：廣東湛江霞山水產品市場，將羅非魚去頭、去鱗、去鰭、去內臟，洗凈，于采肉機中采肉后-18℃凍藏；胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase2.4L：Sigma公司；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶：南寧龐博生物有限公司；均為食品級。

水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市佳美儀器有限公司；電子分析天平：日本島津公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機：日本日立公司；UV-8000紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；pHS-3C型實驗室pH計：上海偉業儀器廠；5K MWCO超濾離心管：上海摩速科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解

在水浴恒溫振蕩器中酶解，酶解完成后沸水浴滅酶10 min，8000 r/min、4℃離心20 min得到上清液即為酶解液。

1.2.2 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力的測定采用福林法[14]。

1.2.3 水解度的測定

電位滴定法[15]測α-氨態氮含量。魚肉總氮含量的測定采用半微量凱氏定氮法[16]。

1.2.4 肽含量的測定

用截留限為5K的超濾離心管對酶解液進行超濾，雙縮脲法測定超濾透過液肽含量。采用胰島素做標準曲線，回歸方程為：y=0.0532x-0.0278（R2=0.9999）。

2 結果與討論

2.1 酶的篩選

酶的篩選，見表1。

表 1 蛋白酶的酶解條件Table 1 Experimental conditions of proteases

選擇5種蛋白酶在相同酶活力單位添加量及各自的適宜條件下（表1）酶解2 h，測得水解度及肽含量如圖1所示。

由圖1可知，水解度由高到低依次為中性蛋白酶>胰蛋白酶>Alcalase2.4L>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶。肽含量由高到低依次為木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>Alcalase2.4L>胰蛋白酶>胃蛋白酶。中性蛋白酶酶解液肽含量僅次于木瓜蛋白酶，水解度最高且價格較低，綜合考慮，選擇中性蛋白酶為最適用酶。

2.2 中性蛋白酶酶解條件的單因素試驗

中性蛋白酶一般在pH6～7穩定，而且實際生產中調節pH難以操作，所以單因素試驗中只考慮加酶量、料液比、溫度和時間單因素對水解度及肽含量的影響。

2.2.1 加酶量的影響

在料液比1∶1（g/mL），溫度50 ℃，自然pH條件下酶解2 h，結果如圖2所示。

由圖2可知，水解度隨加酶量的增加而增加。當加酶量由0.4%升到0.8%時，肽含量逐漸增加，加酶量在0.8%到1.2%之間時，肽含量變化不大。這說明在其它條件一定的情況下，在一定范圍內肽含量隨酶濃度的增加而增加，超過一定范圍時肽含量則不再增加，這或許是因為在底物的量一定時，過多的酶也不能增加肽含量的緣故。

2.2.2 料液比的影響

在加酶量1.0%，溫度50℃，自然pH條件下酶解2 h，結果如圖3所示。

由圖3可知，水解度隨料液比的增加而增加。當料液比為1∶1.5（g/mL）時，肽含量最高。料液比的增加意味著底物濃度與酶濃度的同時降低，在一定范圍內，肽含量會隨料液比的增加而增加，超過一定范圍，肽含量則會隨料液比的增加而不斷下降。

2.2.3 溫度的影響

在加酶量1.0%，料液比1∶1.5（g/mL），自然pH條件下酶解2 h，結果如圖4所示。

由圖4可知，溫度為45℃時水解度最高，溫度為50℃和55℃時，肽含量最高且無顯著差異（p＞0.05）。溫度因素對酶解過程的影響包括對酶活力的影響以及對底物的影響2個方面。對酶活力的影響方面，當溫度為最適溫度時，酶活性最高，低于或高于最適溫度，酶活性降低甚至失活。對底物的影響方面，當溫度高于一定值時，底物魚蛋白開始變性，變性程度隨溫度的變化而變化。不同的變性程度意味著蛋白暴露位點的不同，同時酶解效果也不同。

2.2.4 時間的影響

在加酶量1.0%，料液比1∶1.5（g/mL），溫度50 ℃，自然pH條件下進行酶解，結果如圖5所示。

由圖5可知，水解度隨時間的增加而增加，3 h之后增速減緩，這可能是由于底物濃度降低及酶活力下降共同造成的。1 h～2 h時肽含量增加較多，2、3、5 h相差不大，5 h到7 h下降較多。說明酶解初始階段大分子降解為小分子肽的速度大于游離氨基酸的生成速度，酶解末尾階段則相反。

2.3 均勻設計優化酶解條件

單因素試驗顯示，中性蛋白酶的熱穩定性較差，因此在溫度50℃，自然pH條件下采用U10（108）均勻設計表[17]擬水平法進行加酶量、料液比、時間3因素5水平試驗，試驗方案及結果見表2。

表 2 均勻設計試驗方案及試驗結果Table 2 Experiment program and results of uniform design

利用JMP 7軟件對均勻設計試驗結果進行回歸分析，得到回歸方程如下：

回歸方程及系數的顯著性分析結果如表3所示。

表 3 回歸方程及系數顯著性檢驗Table 3 Significance test of regression equations and its

由回歸方程顯著性可知，兩方程均顯著。由回歸系數顯著性可知，對水解度高低的影響由大到小依次為：時間>料液比>加酶量，對肽含量高低的影響由大到小依次為：加酶量>時間>料液比，兩者并不相同。

水解度預測值如圖6所示。

當加酶量為1.15%，料液比為1∶3（g/mL），時間為5.53 h時，水解度最大，為19.39%。肽含量預測值如圖7所示。

當加酶量為1.38%，料液比為1∶3（g/mL），時間為7 h時，肽含量最高，為37.80 mg（以每克魚肉計）。

優化條件下分別做3次驗證試驗，測得水解度為（19.18±0.12）%，與預測值相差1.1%[此時肽含量（以每克魚肉計）為24.58 mg]，測得肽含量（以每克魚肉計）為（37.71±0.11）mg，與預測值相差0.24%（此時水解度為18.40%），兩方程均預測準確。

3 結論

以水解度和肽含量為指標，對胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase 2.4L、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行篩選，選出中性蛋白酶為酶解羅非魚肉蛋白的最適用酶。

對中性蛋白酶酶解羅非魚肉的酶解工藝進行單因素試驗和均勻設計優化試驗，得到最高水解度酶解條件：加酶量1.15%，料液比1∶3（g/mL），溫度50 ℃，自然pH，時間5.5 h，最高肽含量酶解條件：加酶量1.38%，料液比1∶3（g/mL），溫度50 ℃，自然pH，時間7 h。驗證試驗證明回歸方程可以較好的預測試驗結果。

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Preparation of High Peptide Content Hydrolysate from Tilapia by Uniform Design

HAN Dao-cai1，2，HONG Peng－zhi1，2，*，YANG Ping1，2
（1.Food Science and Technology College，Guangdong Dong Ocean University，Zhanjiang 524025，Guangdong，China；2.Key Laboratory of Guangdong Higher Education Institutions for Advanced Processing of Aquatic Product，Zhanjiang 524025，Guangdong，China）

Neutral protease was chosen the best for obtaining high peptide content tilapia flesh hydrolysate from pepsin，trypsin，Alcalase2.4 L，neutral protease and papain，while the degree of hydrolysis and peptide content as the indicators.Based on the results of single－factor experiments，the uniform design experiment had been done to optimize the enzymatic conditions of neutral protease.The optimum conditions for peptide content were that the enzyme quantity 1.38%，the solid－liquid ratio 1∶3（g/mL），the temperature 50 ℃，the inherent pH and the time 7 h.And the peptide content was（37.71±0.11）mg（per gram fish flesh）at the optimum conditions.

tilapia；enzymatic hydrolysis；uniform design；peptide content；degree of hydrolysis

廣東省粵港關鍵領域重點突破項目（2009A020700004）；廣東省海洋漁業科技推廣專項項目[A2009002-01（a）]

韓道財（1988—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：水產品高值化加工與利用。

*通信作者

2011-07-05