石榴皮提取物體外抗氧化活性比較研究

唐鵬程，焦士蓉，唐遠(yuǎn)謀，符雷蕾

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

石榴皮提取物體外抗氧化活性比較研究

唐鵬程，焦士蓉*，唐遠(yuǎn)謀，符雷蕾

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

研究石榴皮提取物的體外抗氧化作用。采用羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）、2，2-二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的生成體系，研究石榴皮提取物及綠茶多酚、沒(méi)食子酸為對(duì)照，對(duì)自由基的清除能力和對(duì)小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用。結(jié)果表明：石榴皮提取物對(duì)羥自由基、超氧陰離子、DPPH·的半清除率分別為：IC50=71.37 mg/mL、SC50=557.55 mg/mL、DC50=31.98 mg/mL；沒(méi)食子酸對(duì)這3種自由基的半清除率分別為：IC50=51.85 mg/mL、SC50=289.2mg/mL、DC50=37.65mg/mL；綠茶多酚對(duì)這3種自由基的半清除率分別為：IC50=66.67mg/mL、SC50=1043.91mg/mL、DC50=22.48 mg/mL。石榴皮提取物對(duì)小鼠肝組織勻漿的脂質(zhì)過(guò)氧化半抑制率EC50=5.21 mg/mL、沒(méi)食子酸半抑制率EC50=22.82 mg/mL、綠茶多酚半抑制率EC50=3.47 mg/mL。研究表明石榴皮提取物較沒(méi)食子酸和綠茶多酚具有良好的清除自由基及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。石榴皮提取物能有效清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH·自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，具有進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

石榴皮；羥自由基；超氧陰離子自由基；DPPH·；脂質(zhì)過(guò)氧化；抗氧化

自由基在人體內(nèi)處于不斷產(chǎn)生和不斷清除的動(dòng)態(tài)平衡中，自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)少，就會(huì)造成對(duì)組織的傷害[1]。Harman[2]在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上完善了自由基理論：認(rèn)為自由基攻擊生命大分子從而造成組織細(xì)胞損傷，是引起機(jī)體衰老、腫瘤和一些其它疾病的根本原因。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明[3-4]，石榴皮多酚具有顯著的抗氧化和清除自由基作用,石榴皮作為天然的抗氧化劑，來(lái)源廣泛、提取率高、抗氧化活性強(qiáng)、與機(jī)體親和力強(qiáng)和安全性高等特點(diǎn)具有合成抗氧化劑無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，是今后的研究重點(diǎn)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和自由基科學(xué)越來(lái)越多地證明自由基與許多生命現(xiàn)象的疾病密切相關(guān)[5]。石榴皮多酚提取物能有效的清除自由基起到抗氧化作用，有效地防止自由基對(duì)健康細(xì)胞的破壞作用，有效地防止機(jī)體衰老。

本次在提取石榴皮總多酚的基礎(chǔ)上，研究石榴皮提取物對(duì)羥自由基、2，2-二苯代苦味?；杂苫?、超氧陰離子自由基的清除作用和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，為開(kāi)發(fā)高效天然抗氧化劑提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴皮：產(chǎn)于四川會(huì)里，購(gòu)于成都中藥飲品有限公司；綠茶多酚對(duì)照品：WAGON公司；沒(méi)食子酸對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；福林-酚試劑（Folin-Ciocalteu's phenol reagent）、2,2-二苯代苦味酰基（2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：sigma；其余試劑均為分析純。

清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，體重18 g～20 g：由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

UV－2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯上海光譜儀器有限公司；過(guò)濾裝置：鄭州杜甫儀器廠；BT－423S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Heto Lyolab 3000凍干機(jī)：Denmark；微波萃取儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠，等。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮提取物的制備

采用通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳提取工藝提取石榴皮多酚，微波輔助提取工藝條件為：篩目大于80目、溫度75 ℃、料液比1∶30、提取時(shí)間140 s，提取溶劑為蒸餾水，依照此條件獲得的提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和冷凍干燥，采用福林-酚比色法測(cè)得凍干粉末總多酚含量為49.31%。

1.2.2 抗氧化方法

1）羥自由基（·OH）的清除：采用亞鐵離子催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥自由基（Fonton反應(yīng)）方法[6]。取0.75mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL，磷酸緩沖液（PBS）2 mL和蒸餾水1 mL，充分混勻后，加0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL，混勻，加0.01%的過(guò)氧化氫1mL，于37℃保持60min，于536nm處測(cè)其吸光度，其值為AP。用1 mL 30%的乙醇代替1 mL過(guò)氧化氫，測(cè)得吸光度為AB。用試樣1 mL代替1 mL蒸餾水，測(cè)得吸光度為AS。按下式計(jì)算·OH清除率（d1）：

2）2，2-二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除：參照文獻(xiàn)[7]，并作適當(dāng)修正。準(zhǔn)確稱(chēng)取DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，無(wú)水乙醇定容至250 mL，得質(zhì)量濃度為0.04 g/L溶液。取此溶液3mL，加入相同質(zhì)量濃度樣品溶液1 mL，搖勻，室溫放置30 min，517 nm處測(cè)吸光度（Ai）。同時(shí)測(cè)1 mL溶劑與3 mL DPPH·混合后吸光度（Ac），1 mL樣品液加3 mL乙醇混合后吸光度（Aj）。按下式計(jì)算DPPH·清除率（d2）：

3）超氧陰離子自由基（·O2-）的清除：參考文獻(xiàn)[8]方法，取50 mmol/L、pH 8.2的Tris-HC1緩沖液4.5 mL于試管中，置25℃水浴預(yù)熱20 min，加入不同質(zhì)量濃度的待測(cè)樣品0.1 mL，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混勻后在25℃水浴反應(yīng)4 min，8 mol/L鹽酸2滴終止反應(yīng)，（299±1）nm處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以0.1 mL蒸餾水代替待測(cè)樣品溶液，并按下式計(jì)算·O2-清除率（d3）：

4）脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用：參考文獻(xiàn)[9]方法稍作修改，小鼠死后取肝洗凈血污，剪碎用生理鹽水制3%勻漿，取次液0.6 mL加入各種試劑，反應(yīng)液總體積為1.34 mL，含不同濃度藥液0.34 mL，0.0024%雙氧水0.2 mL，0.03 mmol硫酸亞鐵0.2 mL，37 ℃保溫60 min，加入2 mL 20%三氯乙酸及2 mL 0.67%2-硫代巴比妥酸（TBA），90℃保溫15 min后于4000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定A532nm處的吸光值，以水代替TBA為背景，以水代替藥液為空白，并如下公式計(jì)算脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率（d4）：

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴皮提取物的自由基清除活性研究

2.1.1 對(duì)DPPH·的清除作用

以沒(méi)食子酸和綠茶多酚為對(duì)照，測(cè)定石榴皮提取物的DPPH自由基清除活性和半抑制濃度的比較，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

石榴皮提取物半清除率DC50=31.98 mg/L、沒(méi)食子酸半清除率DC50=37.65 mg/L、綠茶多酚半清除率DC50=22.48 mg/L。圖2顯示，石榴皮提取物的DPPH·清除活性高于沒(méi)食子酸，低于綠茶多酚。

2.1.2 對(duì)羥自由基（·OH）的清除

以沒(méi)食子酸和綠茶多酚為對(duì)照，測(cè)定石榴皮提取物對(duì)·OH（羥自由基）的清除活性，結(jié)果見(jiàn)圖3，半抑制濃度的比較見(jiàn)圖4。

石榴皮提取物半清除率IC50=71.37 mg/L、沒(méi)食子酸半清除率IC50=51.85 mg/L、綠茶多酚半清除率IC50=66.67 mg/L。圖4顯示，石榴皮提取物的·OH清除活性低于綠茶多酚和沒(méi)食子酸。

2.1.3 對(duì)超氧陰離子（·O2-）的清除

以沒(méi)食子酸和綠茶多酚為對(duì)照，測(cè)定石榴皮提取物對(duì)·O2-的清除活性，結(jié)果見(jiàn)圖5，半抑制濃度比較見(jiàn)圖6。

石榴皮提取物半清除率SC50=557.55 mg/L、沒(méi)食子酸半清除率SC50=289.20 mg/L、綠茶多酚半清除率SC50=1043.91 mg/L。圖6顯示，石榴皮提取物·O2-的清除活性高于綠茶多酚，是其清除活性的1.87倍，但低于沒(méi)食子酸。

2.2 石榴皮提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

以沒(méi)食子酸和綠茶多酚為對(duì)照，測(cè)定石榴皮提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖7，半抑制濃度的比較見(jiàn)圖8。

石榴皮提取物半抑制率EC50=5.21 mg/L、沒(méi)食子酸半抑制率EC50=22.82 mg/L、綠茶多酚半抑制率EC50=3.47 mg/L。圖8顯示，石榴皮提取物脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用高于沒(méi)食子酸，是其抑制作用的4.38倍，但低于綠茶多酚。

3 討論

研究表明，氧化損傷是導(dǎo)致癌癥和慢性疾病的一個(gè)重要機(jī)制，對(duì)蔬菜水果包括石榴汁的攝入量高，可降低心血管疾病和患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[7]，因其富含多酚類(lèi)化合物，具有清除自由基和降低氧化損傷帶來(lái)的副作用，研究發(fā)現(xiàn)茶多酚等可作為抗氧化藥物對(duì)心血管起保護(hù)作用[10]。

1）研究表明，石榴皮提取物具有較高的清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH·的作用。與沒(méi)食子酸和綠茶多酚抗氧化活性的比較表明，石榴皮提取物對(duì)DPPH·清除活性高于沒(méi)食子酸，對(duì)·O2-的清除能力高于綠茶多酚，但對(duì)·OH的清除能力低于沒(méi)食子酸和綠茶多酚，其中機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

2）研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度反映了機(jī)體自由基活性的高低及機(jī)體遭受自由基損傷的程度。自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)與許多疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，如炎癥、老年性白內(nèi)障、動(dòng)脈粥樣硬化、老年性癡呆、糖尿病并發(fā)癥、衰老等[11]。石榴皮水提物具有抑制小鼠肝組織勻漿的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，且高于沒(méi)食子酸對(duì)照，提示石榴皮可作為一種食品補(bǔ)充劑，降低氧化損傷帶來(lái)的心血管疾病及慢性病的風(fēng)險(xiǎn)。

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Comparison and Study on the Antioxidant Activity of Pomegranate Peel Extract

TANG Peng－cheng，JIAO Shi－rong*，TANG Yuan－mou，F(xiàn)U Lei－lei
（School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

Antioxidative activity of Pomegranate Peel extract in vitro was studied.The effect of free radicals scavenging was investigated with different special chemical systems of hydroxyl radical（·OH），superoxide radicals（·O2－），1，1－dipheny－2－picryhydrazyl free radical（DPPH·）radical and inhibitor lipid－peroxidation with homogenates of mouse liver.Ability of Pomegranate Peel extract for half－inhibition of hydroxyl radical and superoxide radicals and DPPH· radicals was as follows：IC50＝71.37 mg/mL，SC50=557.55 mg/mL，DC50=31.98 mg/mL，respectively.Half－inhibition of gallic acid was ：IC50＝51.85 mg/mL，SC50=289.2 mg/mL，DC50=37.65mg/mL，respectively.Half－inhibition of greenteapoly phenols was：IC50＝66.67mg/mL，SC50=1043.91mg/mL，DC50=22.48 mg/mL，Inhibitive effects of Pomegranate Peel extract on lipid－peroxidation of homogenates of mouseliverEC50was5.21mg/mL，GallicacidEC50was22.82mg/mL，Greenteapoly phenols EC50was 3.47 mg/mL，respectively.Pomegranate Peel extract had a good inhibition against lipid-peroxidation.A linear relationship existed between free radicals scavenging ability and inhibitive effects on lipid-peroxidation with treatment of Pomegranate Peel extract.The extract of Pomegranate Peel can effectively scavenge free radical and inhibit lipid-peroxidation significantly.

Pomegranate Peel；hydroxyl radical；superoxide radicals；DPPH·；lipid－peroxidation；antioxidant

西華大學(xué)2008校人才培養(yǎng)與引進(jìn)科研課題（R0820501）;四川省教育廳自然重點(diǎn)項(xiàng)目（09ZA158）

唐鵬程（1985—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

*通信作者：焦士蓉（1968—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

2011-04-15