放射線照射引起膠質(zhì)瘤細胞細胞周期和凋亡的動力學變化及其對Chk1/2蛋白表達的影響

李勇 賴潤龍 陳煜 譚殿輝 雷霆

放療在膠質(zhì)瘤臨床治療中占有舉足輕重的地位，放療的療效好壞很大程度上取決于DNA損傷檢測點的功能狀態(tài)。目前國外研究多采用同步化處理的腫瘤細胞來建立G2/M阻滯模型[1]，本研究采用更能真實反映細胞內(nèi)在生物學特性的非同步化的腫瘤細胞，研究放療作用下，膠質(zhì)瘤細胞的細胞周期和凋亡的內(nèi)在動力學變化并討論放射線損傷對Chk1和Chk2蛋白表達的影響，以了解膠質(zhì)瘤細胞中Chk1和Chk2對照射后細胞周期的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系培養(yǎng)及照射 本課題采用人膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞株，由武漢大學典型物保藏中心提供。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)對U251細胞進行復蘇、培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再進行傳代。將5×105細胞接種于6孔板中，室溫下采用瑞典Elekta公司SLi型直線加速器，250 Gy/min 6 MV X線照射分別給予6 、10 、15 Gy三種劑量的照射。于6、12、24、48、60 h收獲細胞和上清，800 r/min離心5 min，加入75%冰乙醇1 ml固定，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率(PI法) 取出固定的細胞，制成單細胞懸液，離心洗滌后加入75%的冰乙醇1 ml固定過夜。再次洗滌離心后加入500 μl染液(240 μl PBS、10 μl RNase(1 mg/ml)、250 μl碘化丙錠(50 μg/ml)(propidium iodide，PI))，室溫避光孵育 20 min，流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡率。

1.2.2 Western blot法檢測Chk1、Chk2蛋白表達量 收集的U251細胞，裂解后離心，將上清轉(zhuǎn)管后于-80 ℃凍存，采用Bradford方法測定Chk1/2蛋白質(zhì)濃度。收集的蛋白質(zhì)樣本采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分別檢測Chk1/2蛋白及磷酸化的Chk1-S345及Chk2-T68蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 U251細胞株細胞周期和凋亡的動力學特點 人膠質(zhì)瘤細胞系U251經(jīng)過6 Gy的射線照射后，引起的G2/M期阻滯較弱，當劑量增加至10 Gy，照射24 h后引起非常顯著的G2/M期阻滯，達77.35%，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的時間依賴效應和劑量依賴效應(見圖1)。

隨著時間延長(24 h后)，阻滯于G2/M期的細胞開始釋放，一部分細胞繼續(xù)進入細胞周期，而另一部分細胞走向凋亡，表現(xiàn)為細胞凋亡明顯增加(見圖2)。而當劑量增加至15 Gy時，沒有出現(xiàn)明顯的細胞周期阻滯現(xiàn)象，而直接表現(xiàn)為凋亡的增加。

圖1 U251細胞照射后細胞周期阻滯趨勢示意圖

圖2 U251細胞照射后細胞凋亡趨勢示意圖

2.2 Western blot法檢測U251細胞照射后Chk1和Chk2蛋白的表達 接受不同劑量射線照射后，U251細胞中Chk1、Chk2蛋白表達水平與未照射相比均無明顯變化。采用磷酸化抗體檢測發(fā)現(xiàn)，照射前后Chk1-S345無明顯磷酸化；但照射后6 h，Chk2-T68即出現(xiàn)明顯的磷酸化，12 h達到峰值，24 h后Chk2-T68磷酸化水平開始下降，至60 h Chk2-T68磷酸化水平已基本趨于正常，但Chk2-T68磷酸化水平與照射劑量無關(guān)，6 Gy與10 Gy照射后相同時間點Chk2-T68磷酸化水平無明顯差別(P>0.05)。見圖3。

圖3 Western blot法檢測照射后Chk1/2蛋白表達

3 討論

在長期進化過程中，機體形成了一套防止DNA發(fā)生損傷/錯誤的細胞周期監(jiān)控機制，使機體遺傳信息能夠準確無誤地傳遞到子細胞，這一套監(jiān)控機制統(tǒng)稱為DNA損傷檢測點。在放療條件下，DNA損傷檢測點的激活，有利于腫瘤細胞DNA損傷/錯誤的修復，客觀上為細胞的生存提供了條件，本質(zhì)上是一種細胞的自我保護程序[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，U251細胞株在正常培養(yǎng)條件下主要處于G1/G0期，這與體外培養(yǎng)的其他哺乳動物細胞生長特性相似[3]。對膠質(zhì)瘤U251細胞株進行射線照射處理后建立了U251細胞G2/M期的細胞周期阻滯模型，發(fā)現(xiàn)10 Gy射線照射24 h后引起非常顯著的G2/M期阻滯，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的時間依賴效應和劑量依賴效應。隨著時間延長(24 h后)，阻滯于G2/M期的細胞開始釋放，一部分細胞繼續(xù)進入細胞周期，而另一部分細胞走向凋亡，表現(xiàn)為細胞凋亡明顯增加。目前研究發(fā)現(xiàn)，照射所致的G2/M期阻滯比G1期阻滯更為普遍，大部分腫瘤細胞在接受照射后表現(xiàn)為G2/M期阻滯，而僅有p53(＋)和Rb(＋)表型的細胞接受照射后產(chǎn)生G1期阻滯，因為只有p53和Rb正常，且有p21參與時，細胞受到照射時才產(chǎn)生G1/S期阻滯，而大部分腫瘤細胞存在p53或Rb異常，因而喪失了G1/S期檢測點的功能，僅保留了G2/M期檢測點的功能，成為腫瘤細胞在損傷刺激下出現(xiàn)的自我保護機制的最后一道屏障[4]。

由于正常終末細胞的細胞周期基本處于停滯狀態(tài)，大多數(shù)細胞均處于G1期，當其接受照射后依然表現(xiàn)周期停滯狀態(tài)，無G2/M期阻滯表現(xiàn)，因此，封閉正常細胞的Chk1，Chk2其效果將較腫瘤細胞為差，因為Chkl和Chk2主要參與G2/M期阻滯，所以，封閉Chk1，Chk2本身就有腫瘤特異性，具有較強的靶向性，這將有利于擴大腫瘤治療的治療窗，提高治療效果[5]。

研究還發(fā)現(xiàn)，U251細胞接受不同劑量的照射處理后，引起細胞周期阻滯的程度有一定的差異，在6 Gy的射線作用下，僅引起較輕微的G2/M期阻滯；在10 Gy射線作用24 h后，G2/M期阻滯達77.35%；當照射劑量增加至15 Gy時，則沒有明顯的細胞周期阻滯現(xiàn)象，而直接表現(xiàn)為凋亡的增加。這是因為當損傷較小或有望修復時，細胞通過一系列調(diào)節(jié)機制抑制細胞周期的進行，抑制DNA的復制，阻止細胞的分裂，為DNA修復系統(tǒng)提供充足的時間進行DNA修復，若修復成功，細胞繼續(xù)進行或完成下一個細胞周期事件，若不能修復，細胞則發(fā)生凋亡[3]。同時，在觀察U251細胞周期和凋亡的動力學變化中發(fā)現(xiàn)，細胞周期阻滯的程度在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為照射劑量依賴性增強，而細胞凋亡均發(fā)生于細胞周期阻滯解除后，其強度與細胞周期激活的程度成反比。

本研究發(fā)現(xiàn)，在接受不同劑量射線照射后U251細胞中Chk1和Chk2蛋白表達并不受影響，這與以往文獻報道結(jié)果相一致[6]。Chk1和Chk2激酶主要在磷酸化激活后發(fā)揮作用，Chk1激酶第345位絲氨酸是其激酶激活的重要磷酸化位點[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，射線照射后并不影響U251細胞中Chk1-S345的磷酸化，原因在于Chk1-S345主要由藥物作用后被磷酸化，但Chk1激酶對照射后細胞周期檢測的點功能維持也非常重要。照射后主要以Chk2激酶磷酸化激活為主，Chk2激酶第68位蘇氨酸磷酸化在Chk2激酶激活中極為關(guān)鍵[8]，Chk2-T68被磷酸化后，繼而引起Chk2自動磷酸化和激酶激活。照射后只影響Chk2-T68的磷酸化水平，不影響Chk1、Chk2蛋白水平的表達，磷酸化水平高低與照射劑量無明顯關(guān)系。

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