活化條件對固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活的影響

趙國群，周雪艷，胡弢

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

果葡糖漿是一種新發(fā)展起來的淀粉糖品，其糖分組成主要是果糖和葡萄糖。果葡糖漿具有甜度高，風味好，發(fā)熱量低，溶解度高，滲透壓大等特點，是蔗糖的很好代用品，因而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，尤其是軟飲料工業(yè)[1-2]。工業(yè)上生產(chǎn)果葡糖漿一般采用玉米淀粉為原料，先經(jīng)過雙酶液化，糖化，轉(zhuǎn)化為葡萄糖溶液，然后采用固定化葡萄糖異構(gòu)酶進行異構(gòu)化反應(yīng)，得到果糖和葡萄糖的混合液即果葡糖漿，再經(jīng)脫色，樹脂處理，蒸發(fā)濃縮，得到42%的果葡糖漿[3]。為了方便儲運及較高的穩(wěn)定性，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的商品形態(tài)為干燥的顆粒，其中只含極少量的水，因此酶顆粒使用前需進行活化（水化）。活化過程就是用底物（葡萄糖漿）來使酶顆粒吸收水分，從而使酶發(fā)揮其催化功效[4]。關(guān)于葡萄糖異構(gòu)酶的固定化方法、穩(wěn)定性和葡萄糖異構(gòu)化的研究很多，但是關(guān)于固定化葡萄糖異構(gòu)酶活化的研究卻尚未見報道[5-7]。本文對固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最佳活化條件進行了研究，以期提高活化后的酶活，進而提高葡萄糖異構(gòu)為果糖的生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 主要材料

GENSWEETTMIGI-SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶（簡稱異構(gòu)酶）：無錫杰能科生物制品有限公司產(chǎn)品，粒徑300～1200 μm，淺棕黃色；葡萄糖：石家莊華營葡萄糖有限公司。

1.2 主要儀器

1100型高效液相色譜儀：安捷倫。

1.3 方法

1.3.1 活化時間對異構(gòu)酶酶活的影響

配制濃度為30%的葡萄糖溶液100 mL，用0.2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取6支試管，每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL所配制的葡萄糖溶液，然后將試管置于40℃水浴鍋中分別浸泡（活化）0、1、2、3、4、5h。傾倒、瀝干糖液，測定酶活。

1.3.2 糖液濃度對異構(gòu)酶酶活的影響

分別配制濃度為 30%、40%、50%、60%、70%（W/V）的葡萄糖溶液100 mL，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取5支試管，每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL所配制的葡萄糖溶液。將試管置于40℃水浴鍋中活化4 h。傾倒、瀝干糖液。

1.3.3 溫度對異構(gòu)酶酶活的影響

配制濃度為60%的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取5支試管，每支試管中加入0.2g異構(gòu)酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，分別在25℃、35℃、45℃、55℃、70℃水浴鍋中活化4 h。

1.3.4 糖液pH值對異構(gòu)酶酶活的影響

分別將60%葡萄糖溶液的pH調(diào)整為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。取5支試管，每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL所配制的葡萄糖溶液，然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4 h。

1.3.5 金屬離子對異構(gòu)酶酶活的影響

配制濃度為60%的糖液400 mL，用NaOH溶液調(diào)pH到7.5，并均分到5個燒杯中，然后分別添加MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4，配制成 1.0 mmol/L 的葡萄糖液。取4支試管，每支試管中加入0.2 g異構(gòu)酶和5 mL配制好的含金屬離子葡萄糖溶液，然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4 h。

1.4 分析方法

1.4.1 果糖含量的測定

本試驗采用高效液相色譜法來測定果葡糖漿中果糖的含量。其檢測條件為：Waters Sugar-Park色譜柱，示差折光檢測器，流速0.5 mL/min，溫度70℃，流動相純水，流速0.5 mL/min，進樣量20.0 μL。

1.4.2 固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活的測定

本試驗按照GB 8274-87（固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑）中所示的方法測定葡萄糖異構(gòu)酶的酶活。0.2 g固定化葡萄糖異構(gòu)酶在葡萄糖溶液活化之后，傾倒、瀝干糖液，加磷酸緩沖液1.5 mL，硫酸鎂溶液0.5 mL，葡萄糖溶液1.5 mL，再加去離子水定容至5 mL，70℃反應(yīng)1 h，加高氯酸溶液5 mL終止反應(yīng)，用高效液相法測定其中果糖含量。異構(gòu)酶的酶活力定義為：在pH為7.5，溫度為70℃的條件下，每小時生成1 mg果糖所需的最小酶量為1個酶活力單位。

異構(gòu)酶酶活（U/g）=果糖濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×10（mL）÷ 酶質(zhì)量（g）

2 結(jié)果與討論

2.1 活化時間的影響

將固定化葡萄糖異構(gòu)酶浸泡在30%葡萄糖溶液（40℃）中進行活化，控制不同的活化時間，然后測定其酶活，結(jié)果見圖1。

圖1 活化時間對異構(gòu)酶酶活的影響Fig.1 Effect of activation time on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

從圖1中發(fā)現(xiàn)，活化1 h的異構(gòu)酶酶活卻明顯低于未經(jīng)過活化的異構(gòu)酶。隨著活化時間的延長，異構(gòu)酶酶活逐漸提高。當活化時間為4 h時，其酶活達到最高，為720.3 U/g。然而，當活化時間延長到5 h時，異構(gòu)酶酶活又顯著下降，低于未經(jīng)過活化的異構(gòu)酶。為了方便儲存和運輸，異構(gòu)酶固定化后被生產(chǎn)為干態(tài)。在干燥過程中，異構(gòu)酶因失水而發(fā)生空間構(gòu)象的變化，進而影響其酶活。在葡萄糖溶液中進行活化時，異構(gòu)酶的空間構(gòu)象趨于恢復(fù)原態(tài)，其恢復(fù)的程度可能與活化時間、活化溫度、糖液濃度等有關(guān)，也可能與固定化時使用的固定載體有關(guān)。或許正是這些影響因素不恰當組合，使得活化后的異構(gòu)酶空間構(gòu)象恢復(fù)的不理想或最佳空間構(gòu)象未能長時間保持，從而活化時間過短或過長均造成異構(gòu)酶酶活降低。

2.2 糖液濃度的影響

在果葡糖漿的生產(chǎn)上，通常使用40%～50%的葡萄糖漿（純度93%）進行活化[4]。考慮到果葡糖漿的實際生產(chǎn)，本試驗采用的活化介質(zhì)為葡萄糖溶液。將固定化葡萄糖異構(gòu)酶分別在30%、40%、50%、60%、70%（W/V）的葡萄糖溶液中40℃下活化4h，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 糖液濃度對異構(gòu)酶酶活的影響Fig.2 Effect of syrup concentration on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

如圖2所示，糖液濃度對異構(gòu)酶酶活有著顯著的影響。當糖液濃度為60%時，異構(gòu)酶酶活最高，達到了811 U/g，同40%葡萄糖溶液的相比，異構(gòu)酶酶活提高了233 U/g。

2.3 活化溫度的影響

異構(gòu)酶固定化后，耐溫性增強，但當溫度超過70℃時仍容易變性失活，從而導(dǎo)致酶活降低。因此，生產(chǎn)商建議的活化溫度為25℃～55℃，見圖3。

圖3 活化溫度對異構(gòu)酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

如圖3所示，在25℃～55℃范圍內(nèi)，隨著糖液活化溫度的升高，異構(gòu)酶酶活逐漸增加。當活化溫度為55℃時，活化后的酶活最高，達815 U/g，同25℃相比，異構(gòu)酶酶活增加了251.8 U/g。當活化溫度超過55℃時，異構(gòu)酶酶活明顯下降。根據(jù)此試驗結(jié)果，在實際生產(chǎn)中選擇適宜的活化溫度對提高異構(gòu)酶酶活很重要。

2.4 糖液pH值對異構(gòu)酶酶活的影響

根據(jù)來源不同，異構(gòu)酶的最適pH有所差異，一般糖異構(gòu)酶的最適pH在6.5～8.5，見圖4。

圖4 pH對異構(gòu)酶酶活的影響Fig.4 Effect of syrup pH on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

由圖4可見，當糖液pH從6.5升高7.5時，異構(gòu)酶酶活逐漸升高。pH7.5與pH8.0的酶活基本相同。但在堿性條件下高溫（60℃）會使葡萄糖糖漿的顏色加深，所以糖液pH宜選定為7.5。

2.5 金屬離子對酶活的影響

葡萄糖異構(gòu)酶是金屬酶。在葡萄糖異構(gòu)化為果糖時，Mg2+、Co2+、Mn2+等對該酶有激活作用，而 Ca2+、Hg2+、Cu2+等則起抑制作用[8-9]。那么在異構(gòu)酶活化時是否也需加入金屬離子呢？為了考察金屬離子在異構(gòu)酶活化時的影響，在60%葡萄糖溶液中分別添加1.0 mmol/L的 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4，然后 55 ℃下活化 4 h，試驗結(jié)果見圖5。

圖5 金屬離子對異構(gòu)酶酶活的影響Fig.5 Effect of metal ions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

由圖5可見，同未加任何金屬離子的對照相比，異構(gòu)酶活化時添加 Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+不但沒有使酶活升高，反而明顯降低了酶活。這說明Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+在活化時均起抑制作用。造成這種想象的原因不清楚。或許是活化時添加的金屬離子干擾了異構(gòu)酶水化過程中最佳空間構(gòu)象的恢復(fù)，從而造成酶活的降低。

3 結(jié)論

葡萄糖異構(gòu)酶是果葡糖漿生產(chǎn)中的一個關(guān)鍵酶，其酶活的高低直接影響著生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本。本試驗以果葡糖漿生產(chǎn)上普遍使用的GENSWEETTMIGISA固定化葡萄糖異構(gòu)酶為研究對象，研究了活化條件對其酶活的影響。試驗結(jié)果表明活化條件對固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活有著非常顯著的影響。GENSWEETTMIGI-SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶的適宜活化條件為：葡萄糖液濃度60%、溫度55℃、pH 7.5、時間4 h。經(jīng)此條件活化之后，其酶活達815 U/g，同常規(guī)活化條件（例如，葡萄糖液濃度40%、溫度40℃、pH 7.0、時間 4 h）相比，異構(gòu)酶酶活提高了40%以上。此外，還發(fā)現(xiàn)活化時添加 Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+不但沒有使酶活升高，反而明顯降低了酶活。因此，在固定化葡萄糖異構(gòu)酶活化時不適宜加入Mg2+等金屬離子。

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